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1、生物技术通讯序列分析法在医学微生物鉴定中的应用周煌北京微生物流行病研究所北京,摘要序列分析作为微生物系统分类的主要依据已得到了广泛认同随着微生物核糖,。体数据库的日益完善该技术成为细菌分类和鉴定的一个有力工具本文概述了序列分,析法的技术步骤以及该技术在医学微生物研究中的应用总结了目前文献报导的各种致病微生物种,。属特异性引物和探针序列同时分析了该技术在应用中存在的一些问题关键词医学微生物鉴定,‘可,刀,翻舒’一,即,传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和古生菌也称细,生理性状采取的主要方法是对细菌进行纯培养分菌也称和真核生物离,然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特。
2、的三域理论逐渐得到认同并得。,,性加以鉴定本世纪年代开始分子遗传学和分到了基因组研究结果的支持年詹氏产甲烷口“二子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进人了分子球菌。石全部基因序列分析,生物学时代许多新技术和方法在细菌分类学中得,,结果说明甲烷球菌不同于任何已知细菌表明了古。到广泛应用生菌是一个独立的域。序列分析作为微,年代末开始采用寡核昔酸编目生,物分类系统的主要依据也得到了广泛认同随着,法对生物进行分类他通过比较各类生物细胞的核,微生物核糖体数据库的日益完善该技术成为细菌,糖体特征序列认为及其分类和鉴定的一个有力工具。类似的基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据是
3、它们为细胞所共有其功能序列分析的基本原理和技术同源且最为古老既含有保守序列又含可变序列分步骤子大小适合操作它的序列变化与进化距离相适应田。依据序列绘制的生命进化树,核糖体是与核糖体蛋白结合的分。将地球上的所有细胞生物划分为个域子,在蛋白质的翻译中起重要作用。原核生物细菌生物技术通讯和古生菌含有、和等种,其大基因片段的分析方法主要包括以下小分别约为、和个碱基。真核生物与种一是将产物克隆到质粒载体上进行测、。,,之对应的为和其中作为小亚序与数据库中的序列进行比较确定其单位核糖体,的或的在进化树中的位置从而鉴定样本中可能存在的微,通过比,,大小最适合于进化分析较各类生物生物种类该
4、方法获得的信息最全面但在样品成分的基因序列,从序列差异计算它们之间的进复杂的情况下需要大量的测序工作。二是通过化距离,可。以绘制出生物进化树因此序种属特异性的探针与产物杂交以获得列分析技术的基本原理就是从微生物样本中钓取微生物组成信息。此外探针也可以直接与样品进行,、、,的基因片段通过克隆测序或酶切探原位杂交检测通过原位杂交不仅可以测定微生物,,,。针杂交获得序列信息再与的形态特征和丰度而且能够分析它们的空间分布,,,数据库中的序列数据或其它数据进行比较确定其该方法简单快速主要应用于快速诊断但可能出现在进化树中的位置,从而鉴定样本中可能存在的微假阳性或假阴性结果。第三是对产
5、物进行限制生物种类。其技术步骤主要包括以下步。性片段长度多态性,,基因组的获得分析通过观察酶切电泳图,、,。首先从微生物样品中直接提取总对易于谱数值分析确定微生物基因的核糖体型培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。另一,再同核糖体库中的数据进行比较分析样品中种选择是提取微生物细胞中的核糖体。一个典微生物组成或不同微生物的种属关系。型的,细菌含有护一护个核糖体而基因组目前国际上有许多核酸数据库能够检索核糖体,中操纵子即序列的拷贝数相对较少核酸序列一些软件可用于序列对比分析和构建进,,。原核生物一般为个左右因此在细化树如和软件此外一些研,,究胞中的含量很高易于获得较多的模板但
6、是结构还建立了专门用于核糖体序列分析的数据,,易于降解的提取技术相对于的提取较库其中最著名的是美国密歇根州立大学的,,一库,为复杂一般研究多采用提取细胞总但也可该数据库目。,根据情况选择提取由于在死亡的细前包括多个小亚单位序列用户可以,通过匿名。和网胞中很快降解提取通过返转录钓取。序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活使用这些数据体细胞川。和软件,其中网提供的主要服务包括核糖基因片段的获得体探针检测用户委托序列在分类系统中的过去常常将提取的总经酶切后克隆到入大致位置分析筛选可能的嵌合序列自动,序噬菌体中建立库进一步通过通列对准比较提供未知序列在系统发育进化树中。,,的位置以
7、及结果分析等多种功能此外欧用探针进行杂交筛选含有序列的克隆。,洲还,鸟枪法由于技术的产生和发展现在一般有一些核糖体数据库如比利时安特卫普采用引物扩增总中的大学建立的数据库提供多种小亚‘,。,。单位序列「〕其网址为序列或通过反转录获得序列后再进。行分析。采用技术的优点在于不仅一次性从混德国慕尼黑技术大学的,而数据库合或样品中扩增出序列。。,且方便了后面的克隆和测序但也同样会出现提供自动序对准比较。,二级结构检测和进化树构建等程序旧所固有的缺点尤其是采用保守序列的通用,引物对多种微生物混合样品进行扩增可能出。和,现嵌合