应用16srrna基因序列研究快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌

《应用16srrna基因序列研究快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、应用16SrRNA基因序列研究快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌　　[摘要]目的探索一种快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌的方法。方法利用PCR技术扩增待检菌株的16SrRNA基因序列，通过分析待检菌株的16SrRNA基因序列对其进行鉴定。结果5株待检菌株的16SrRNA基因序列均成功扩增，其中4株的16SrRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列相似率达99.9%以上，将其鉴定到种的水平，1株的16SrRNA基因序列与基因库中雷弗森菌属的核酸序列相似率为97.09%，将其鉴定为雷弗森菌属。结论应用16SrRNA基因序列分析可快速、准确

2、地鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌。[关键词]16SrRNA基因；细菌鉴定；革兰氏阳性杆菌[中图分类号]R446.5[文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2014）03（a）-0094-037近年来，随着人口老龄化、免疫损害宿主增加等因素的影响，革兰氏阳性杆菌感染的发病率有升高趋势[1-3]。常见的革兰氏阳性致病杆菌有单核细胞增生性李斯特菌、棒状杆菌、红斑丹毒丝菌、诺卡菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌以及炭疽杆菌等。革兰氏阳性杆菌感染其表型特征的敏感性及特异性较差，通过常规检验手段对其进行快速、准确的鉴定比较困难。2012年3～1

3、0月，本研究从临床标本中相继分离出5株革兰氏阳性无芽胞杆菌。为了快速、准确地鉴定这些菌株，笔者利用PCR技术对其16SrRNA基因进行扩增，然后通过16SrRNA基因序列分析将其鉴定至属或种的水平。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株5株革兰氏阳性杆菌均分离自北京武警总医院各科临床标本，菌株编号分别为QC0411、QC0823、Y0720、Z0802、20983。1.1.2试剂Chelex-100树脂（伯乐公司，美国），琼脂糖G-10（Gene公司，美国），溴乙锭（Promega公司，美国），ExTaq聚合酶试剂盒及DL2000DN

4、AMarker均购自宝生物工程大连有限公司。16SrRNA基因的扩增选用16SrRNA基因细菌通用引物（F：5′-AGAGTT-TGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[4]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.1.3仪器TC-312PCR仪（Techne公司，英国），EPS-100核酸电泳仪（圣科仪器设备有限公司，上海），GelLogic100凝胶电泳成像仪（柯达公司，美国）。1.2方法1.2.1基因组DNA提取7参照文献[5]用Chelex-100法提取。1.2.216

5、SrRNA基因扩增16SrRNA基因扩增反应体系由10×ExTaq缓冲液（Mg2+Plus）5μl、dNTP混合物（各2.5mmol/L）4μl、引物F（10μmol/L）及引物R（10μmol/L）各2μl、ExTaq聚合酶（5U/μl）0.25μl、基因组DNA4μl组成，最后用无菌去离子水补足至50μl。PCR反应条件为95℃预变性5min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸5min。1.2.3扩增结果检测取5μlPCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后通过凝胶电泳成像仪

6、照相观察，确认目标基因扩增成功后，PCR产物送北京天一辉远生物科技公司测序。1.2.4同源性鉴定将测得的16SrRNA基因序列用VectorNTIAdvance（v.11.5.1）序列分析软件包进行人工校读，去除两端测序图谱不清容易引起混淆的序列，并对2个引物的双向测序结果进行拼接[6]。登陆GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）和核糖体工程数据库（http：//rdp.cme.msu.edu/index.jsp），将测得的各菌株的16SrRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列进行

7、同源性比对。2结果72.116SrRNA基因扩增结果所有菌株的16SrRNA基因均扩增成功，反应产物经电泳检测在约1500bp处有一清晰条带，与预期目的片段长度相符（表1）。3讨论传统的细菌鉴定以分离培养为前提，然后依据其形态学、生理生化特征进行鉴定，从标本采集到得出明确的鉴定结果往往需要3～4d甚至更长时间，且准确性不十分理想，给临床及时指导诊治带来一定的困难。微生物自动鉴定系统的推广应用使这一现象有所改观，但这种完全基于表型特征的鉴定技术仍然具有内在的缺陷。PCR扩增技术及DNA分子测序技术的发展，为细菌在基因水平的鉴定提供了技

8、术保障，16SrRNA基因序列分析已被广泛应用于细菌鉴定[7-8]。本研究通过扩增、分析待检菌株的16SrRNA基因序列，对5株革兰氏阳性杆菌进行了快速、准确的鉴定，给临床及时诊治提供了可靠的依据。16SrRNA基因序列揭示了物种间内