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时间:2017-12-05
《应用16srrna基因序列研究快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、应用16SrRNA基因序列研究快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌 [摘要]目的探索一种快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌的方法。方法利用PCR技术扩增待检菌株的16SrRNA基因序列,通过分析待检菌株的16SrRNA基因序列对其进行鉴定。结果5株待检菌株的16SrRNA基因序列均成功扩增,其中4株的16SrRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列相似率达99.9%以上,将其鉴定到种的水平,1株的16SrRNA基因序列与基因库中雷弗森菌属的核酸序列相似率为97.09%,将其鉴定为雷弗森菌属。结论应用16SrRNA基因序列分析可快速、准确
2、地鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌。[关键词]16SrRNA基因;细菌鉴定;革兰氏阳性杆菌[中图分类号]R446.5[文献标识码]A[文章编号]1674-4721(2014)03(a)-0094-037近年来,随着人口老龄化、免疫损害宿主增加等因素的影响,革兰氏阳性杆菌感染的发病率有升高趋势[1-3]。常见的革兰氏阳性致病杆菌有单核细胞增生性李斯特菌、棒状杆菌、红斑丹毒丝菌、诺卡菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌以及炭疽杆菌等。革兰氏阳性杆菌感染其表型特征的敏感性及特异性较差,通过常规检验手段对其进行快速、准确的鉴定比较困难。2012年3~1
3、0月,本研究从临床标本中相继分离出5株革兰氏阳性无芽胞杆菌。为了快速、准确地鉴定这些菌株,笔者利用PCR技术对其16SrRNA基因进行扩增,然后通过16SrRNA基因序列分析将其鉴定至属或种的水平。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株5株革兰氏阳性杆菌均分离自北京武警总医院各科临床标本,菌株编号分别为QC0411、QC0823、Y0720、Z0802、20983。1.1.2试剂Chelex-100树脂(伯乐公司,美国),琼脂糖G-10(Gene公司,美国),溴乙锭(Promega公司,美国),ExTaq聚合酶试剂盒及DL2000DN
4、AMarker均购自宝生物工程大连有限公司。16SrRNA基因的扩增选用16SrRNA基因细菌通用引物(F:5′-AGAGTT-TGATCCTGGCTCAG-3′;R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)[4],引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.1.3仪器TC-312PCR仪(Techne公司,英国),EPS-100核酸电泳仪(圣科仪器设备有限公司,上海),GelLogic100凝胶电泳成像仪(柯达公司,美国)。1.2方法1.2.1基因组DNA提取7参照文献[5]用Chelex-100法提取。1.2.216
5、SrRNA基因扩增16SrRNA基因扩增反应体系由10×ExTaq缓冲液(Mg2+Plus)5μl、dNTP混合物(各2.5mmol/L)4μl、引物F(10μmol/L)及引物R(10μmol/L)各2μl、ExTaq聚合酶(5U/μl)0.25μl、基因组DNA4μl组成,最后用无菌去离子水补足至50μl。PCR反应条件为95℃预变性5min,然后95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环后72℃延伸5min。1.2.3扩增结果检测取5μlPCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色后通过凝胶电泳成像仪
6、照相观察,确认目标基因扩增成功后,PCR产物送北京天一辉远生物科技公司测序。1.2.4同源性鉴定将测得的16SrRNA基因序列用VectorNTIAdvance(v.11.5.1)序列分析软件包进行人工校读,去除两端测序图谱不清容易引起混淆的序列,并对2个引物的双向测序结果进行拼接[6]。登陆GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)和核糖体工程数据库(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp),将测得的各菌株的16SrRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列进行
7、同源性比对。2结果72.116SrRNA基因扩增结果所有菌株的16SrRNA基因均扩增成功,反应产物经电泳检测在约1500bp处有一清晰条带,与预期目的片段长度相符(表1)。3讨论传统的细菌鉴定以分离培养为前提,然后依据其形态学、生理生化特征进行鉴定,从标本采集到得出明确的鉴定结果往往需要3~4d甚至更长时间,且准确性不十分理想,给临床及时指导诊治带来一定的困难。微生物自动鉴定系统的推广应用使这一现象有所改观,但这种完全基于表型特征的鉴定技术仍然具有内在的缺陷。PCR扩增技术及DNA分子测序技术的发展,为细菌在基因水平的鉴定提供了技
8、术保障,16SrRNA基因序列分析已被广泛应用于细菌鉴定[7-8]。本研究通过扩增、分析待检菌株的16SrRNA基因序列,对5株革兰氏阳性杆菌进行了快速、准确的鉴定,给临床及时诊治提供了可靠的依据。16SrRNA基因序列揭示了物种间内
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