应用pcr法快速鉴定临床体液标本中致病真菌

《应用pcr法快速鉴定临床体液标本中致病真菌》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、应用PCR法快速鉴定临床体液标本中致病真菌【摘要】目的用PCR法快速鉴定临床体液标本中的致病真菌。方法应用真菌通用引物ITS4和ITS86对临床体液标本中的致病真菌进行PCR法快速鉴定，扩增产物与对照组相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照。结果临床体液标本直接进行PCR扩增片段的扫描分析结果与DNA扩增结果相近，差异无显著性。结论采用ITS通用引物对临床体液标本中致病真菌进行PCR法鉴定，可准确、特异、快速、敏感地检测致病菌。【关键词】深部真菌感染;临床体液标本;PCR近几年深部真菌病的发病率增高的幅度超过了过去的20年。7这些

2、感染的死亡率高达30%～60%，有36%的真菌血症患者发生组织受累，死亡率达47%～88%，由某些真菌如曲霉和镰刀霉菌均属引起的播散性感染的死亡率接近100%[1]。早期诊断对深部真菌感染的临床结果有着重大影响，在越来越多的耐药菌株出现后，菌种鉴别的重要性已不容忽视。由于目前真菌鉴定还依赖于形态学方法，许多真菌历经数天甚至数周的培养仅获得菌属的鉴定，要鉴定到菌种尚需经过复杂的生化实验和免疫学实验，而大多数菌种，特别是丝状菌只有通过有经验的技术人员才能识别。因此，我们借助于PCR快速鉴定临床体液标本中的致病真菌，可明显缩短检测时间，更早更及时的给予感染深

3、部真菌的患者以治疗。　　1材料与方法　　1.1研究对象临床体液标本，经真菌镜检或培养已经证明为阳性，标本来自长海医院皮肤科真菌室。标本种类分别为胆汁1例、中段尿3例、腹腔引流液1例、胆管引流液1例和肺泡灌洗液1例。　　1.2主要试剂酵母基因组DNA小量快速提取试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司);ExTaq耐热性DNA聚合酶;10×ExTaqBuffer(Mg2+Free);MgC12;2.5mmol/Lmixed-dNTP;DNAMarkerDL2000(均为Takara产品)。　　1.3方法　　1.3.1标本收集长海医院住院患者进行真菌检

4、查的体液标本，标本经镜检或培养已证明为阳性，-20℃保存。　　1.3.2菌种DNA的提取采用酵母基因组DNA小量快速提取试剂盒进行真菌DNA抽提。　　1.3.3样本制备取1000μ7l临床含菌体液标本12000r/min，离心10min，弃上清后，沉淀用30μl三蒸水吹打均匀悬浮。　　1.3.4PCR引物及其分子量标准真菌通用引物ITS4和ITS86[2]，其碱基序列分别为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’和5’-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3’(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。分子量标准为DNAMarke

5、rDL2000。　　1.3.5PCR反应体系总体积40μl，其中10×缓冲液4μl，25mmolMgC123.2μl，2.5mmol/ldNTP3.2μl,样本0.5μl,2×20μmol/L通用引物各1μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl，三蒸水加至40μl。　　1.3.6反应程序及扩增产物检测94℃(初始变性)×10min后，以94℃60s、55℃60s、72℃60s、循环35次，72℃充分延伸10min。取10μl扩增产物做琼脂糖凝胶电泳、EB染色，紫外灯下观察、照相。　　1.3.7质量控制每次实验均设置阴性对照(灭菌三蒸水代替含菌样本本

6、法PCR扩增)和阳性对照(酵母菌DNA抽提试剂盒的方法抽提DNA后PCR扩增)，并严格防止污染。　　2结果　　应用7PCR方法对多个不同种类的临床含菌体液标本进行PCR扩增，标本种类分别为胆汁1例、腹腔引流液1例、胆管引流液1例和肺泡灌洗液1例。其片段大小同阳性对照。见图1。　　3讨论　　近20年来，深部真菌感染发病率明显增加，约占院内感染的7.8%，其中以白念珠菌所占比例最高，约为53.2%;其次为热带念珠菌(12.9%);其他深部真菌分离率均<10%[3]。深部真菌感染发生率上升的原因可能与以下因素有关：(1)广谱抗生素、免疫抑制剂、细胞毒药

7、物的广泛应用;(2)器官移植、导管技术及静脉高营养等技术的开展;(3)严重疾病如恶性肿瘤、糖尿病和艾滋病等。艾滋病患者80%～90%有念珠菌感染[4]。未经治疗的真菌感染病情进展快，死亡率高，尤其是重症监护病房(ICU)患者，高达30%～80%[5]。因此，早期明确诊断是改善预后的重要方面之一。　　为了达到早期明确诊断的目的，并直接应用于临床检测中，本实验特色之处从以下几个方面体现：(1)标本处理简便：直接取临床体液标本，经12000r/min，离心10min，弃上清后，沉淀用三蒸水吹打均匀悬浮。悬浮菌液95℃7加热10min，此方法受到了真菌具有在高

8、温下死亡的特性的启示，真菌经历足够高的温度和足够长的时间会导致真菌细胞壁的崩解，从而使DNA释