禽传染性支气管炎病毒M基因的克隆、序列分析及S1基因玉米表达载体的构建

《禽传染性支气管炎病毒M基因的克隆、序列分析及S1基因玉米表达载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、四川农业大学硕士学位论文禽传染性支气管炎病毒M基因的克隆、序列分析及S<,1>基因玉米表达载体的构建姓名：李春申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：王红宁20030501摘要本研究设计了一对引物M1／M2，通过RT-PCR的方法成功地扩增了8株IBV中国地方分离株S／dB4，S／dB6．SAIB9，S／dBl4、SAIB20．SAIBwj、SA／BRc、和SA／BRc．M基因的目的片段，并通过克隆、序列测定获得了8株分离毒株M基因的核苷酸序列，并在国际基因库GenBank中注册，8株分离毒

2、株M基因全长678bp一681bp，编码225—226个氨基酸残基。将M基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行比较的结果表明IBV分离株彼此间的核苷酸同源性为87．1％-100％，其相应的氨基酸序列的同源性为88．i％-100％。核苷酸序列前150bp的变异最大，不同毒株间存在插入、缺失及点突变等。M基因核苷酸系统进化树分析结果表明8株IBV分离株可分为2个基因群，S．MB4．SAIB6，S．MBwj、SAIBltSAIBRc和SAIBRc．属于I群，与Mass型参考毒株的亲源关系较近，SA／B9

3、和S／dB20属于II群，其中SA／B20与Gray等肾型毒株亲缘关系较近。本研究选取具有代表意义的分离株S．MBl4和SA／B4，设计了引物L1和L2，以其S1基因克隆质粒pUCSAml4和pUCSAIB．为模板，用具有高保真度的pill酶分别扩增到Sl基因片段。把扩增产物分别通过ClaI和BamHI酶切纯化，连接到用ClaI和BamHI切去GFPml基因的中间表达载体pUGFPocs中，转化大肠杆菌JMl09，在含Amp(100Hg／nfl)的LB抗性平板上筛选到了的阳性菌落。提取质粒通过酶

4、切和PCR分析获得了中间载体重组质粒pUSAml4和pUSAIB4；用Kpnl和HindIII双酶切重组质粒pUSAIBl4和pUSAIB4，回收Ubi-Sl-Tocs片段，定向插入到pCAMBIAl300载体的多克隆位点，并转化大肠杆菌JMl09，在含Kan(60“g／mD的LB抗性平板上筛选到了阳性菌落，提取质粒通过酶切和PCR分析获得了玉米表达载体重组质粒pCUSAIBl4和pCUSAIB4。IBVS1基因玉米高效表达载体的成功构建将为进一步进行IBVSI基因在玉米中的表达和免疫保护性研究

5、打下了基础。关键词禽传染性支气管炎M基因克隆序列分析s1基因玉米表达载体前畜1概述禽传染性交气管炎(AvianInfectiousBronchitis，IB)是鸡的一种急性、高度接触传染性疾瘸，是舷害养禽业的最重要传染病之--[¨，呈世界性分布，发生于所有莽鸡的国家和蛾区。本稍的病潦是禽传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisV'nus，姻

6、v)，怒冠状病毒科冠状病毒属的代表株之一【21，它主要侵害呼吸系统和泌尿生殖系统p州，部分毒株还可引起消化道缀织和腺胃的损伤l鞴。m可感

7、染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低；逐常常弓l起霉形体混合感染以及大肠杆慧等继发感染丽提高鸡群的死亡举，给养鸡生产带来巨大损失硅蚺。因此对本病的研究有墼耍的科学价值和经济绘僮。IBV基因缀为单骰难链RNA，本身具有感染性，由于基因组核酸RNA的不连续机制及RNA聚含薅的不凳全校对枫刮，使病毒RNA在复制过程中易发生突变、缺失、撬入或重组，造成大量IBV变异株的出现，使IBV毒株十分复杂，血清型很多[11’121。在生产中，如果所月疫萤毒株的血清型与当地的流行毒株的血清溅不一致

8、，则不戆产生有效的免疫保护作用[13-16]。因此，长期以来国内外的研究人员部在不懈努力、试图阐明IBV的流行、变异擞律、致痪机制以及IBV斑涛型、组织噻性和免疫原性之间的关系，以嬲为生产实践提供有效的预防方法和理论依据。2文救综述2．1IBV主要络构蛋白的研究进展1BV病毒基嚣缀RNA主要编玛3静结构蛋自；纾突蛋鑫(s)、孩衣壳蛋鑫(N)和膜蛋自(M)。三种结构蛋白的摩尔比为l：6：15／翔。2．1。1．终突蛋白(S蛋白)s蛋白位子病毒粒子的囊膜上，是囊膜突起的主要部分。S蛋白包括两种糖多肽S

9、l彝S2，分子蠢约为I$0～200KD，Cavanaga的研究表明，它是巍2-3个相网酶单体以非共价键连接构成的聚合物，每个单体有两个等摩尔分予的亚单位s。、S2构成，Sl约为90KD，由520～538个氮基酸组成，s2约84KD,由625令氮基羧缓成f181，S蛋囊翻译后经过裂解产生Sl的N端和S2的C端，两者之问由二硫键连接，Sl在外形成一个泡状结姆，S2遐逑一个参的巯水跨膜

10、跨段嵌入癍毒膜孛，形成sl的糖，疼sl爨鑫镬是在貘上，裂解处的氨基酸序列模式为：-Arg．A嗜*姆舡g-(c)(熟中