蛋清肽结构鉴定与完整吸收的构效关系研究

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1、18IIIIIIV中文摘要蛋清肽结构鉴定与完整吸收的构效关系研究本研究隶属于国家自然科学基金面上项目《基于Caco-2细胞模型的蛋清肽结构与完整吸收关系研究》（31271907）和《基于Caco-2细胞膜和大鼠外翻肠囊模型的蛋清源活性寡肽完整吸收途径及机制研究》（31771985）。食源性生物活性肽因其良好的生物活性及营养、无毒副作用而受到广泛关注，但是，受到小肠吸收与生物利用率的影响，通过体外方法鉴定的食源性生物活性肽并不一定具有体内生物活性。因为，不同于内源性生物活性肽，许多食源性生物活性肽如ACE抑制肽等要在体内发挥生物活性，需要在经口摄入以后克服胃肠道酶降解和小肠

2、上皮吸收渗透屏障，以完整的形式被小肠上皮吸收进入体内，随血液循环到达作用靶点，并累积到一定的量。其中，胃肠道消化酶的降解和小肠上皮的吸收渗透是主要限制因素。目前，鉴定得到的食源性生物活性肽多为含3~10个氨基酸残基的寡肽，而寡肽的小肠上皮吸收特性和吸收机制尚不明确。本文从蛋清源寡肽入手，利用Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊模型，研究蛋清源寡肽的刷状缘膜酶降解与完整吸收特性，通过末端FITC修饰和氨基酸替换，研究末端氨基酸对寡肽完整吸收的影响，并进行系统的构效关系分析，明确寡肽的疏水性参数和分子量与完整吸收的相关关系，阐释寡肽完整吸收的可能机制。主要研究内容和结果如下：

3、（1）利用Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊模型研究蛋清蛋白模拟胃肠道消化水解物混合肽对刷状缘膜酶的降解与完整吸收情况，利用QExactive质谱对蛋清源刷状缘膜酶降解肽和完整吸收肽进行结构鉴定，并对鉴定得到的肽序列进行统计分析。结果发现，外翻大鼠肠囊对蛋清肽的降解作用大于Caco-2细胞单层膜，但是，分别有56条和28条分子量低于1000Da且主要来自于卵白蛋白和卵转铁蛋白的蛋清肽能够被Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊完整吸收，表明能被Caco-2细胞单层膜完整吸收的蛋清源寡肽数量要远大于外翻大鼠肠囊。另外，分析发现，有LGAKDSTRT、VNDLQGKTS、DG

4、SRQPVDN、GKKDPVLKD共4条蛋清源寡肽能同时被Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊2种模型完整吸收。I（2）利用模拟胃肠道消化体系和Caco-2细胞单层膜模型，研究蛋清源ACE抑制肽TNGIIR在胃肠道消化酶和刷状缘膜酶作用下的降解以及完整吸收情况。结果发现，分别有5.87%±1.92%和17.17%±0.64%的TNGIIR被模拟胃肠道消化酶和刷状缘膜酶降解。但是，TNGIIR仍能被Caco-2细胞单层膜完整吸收，其正-6-6向吸收和反向外排的Papp值分别为（4.92±0.40）×10cm/s和（5.99±0.27）×10cm/s，且只有细胞松弛素D能够显

5、著改变TNGIIR的吸收率，说明TNGIIR在Caco-2细胞单层膜的完整吸收机制可能为受紧密连接调控的细胞旁路途径。（3）测定了末端FITC修饰对RVPSL、RVPSP和VPP在Caco-2细胞单层膜完整吸收的影响。结果发现，FITC-RVPSL和RVPSLK-FITC的Papp值分别为-6-6（0.88±0.11）×10cm/s和（1.43±0.15）×10cm/s，FITC-RVPSP和RVPSPK-FITC-6-6的Papp值分别为（0.66±0.10）×10cm/s和（2.37±0.01）×10cm/s，而FITC-VPP-6-6和VPPK-FITC的Papp值

6、分别为（4.68±0.08）×10cm/s和（3.25±0.08）×10cm/s，说明RVPSL和RVPSP的C末端FITC修饰后在Caco-2细胞单层膜的吸收率大于其N末端FITC修饰肽，而VPP的C末端FITC修饰后在Caco-2细胞单层膜的吸收率小于其N末端FITC修饰肽。RVPSL和RVPSP的C末端FITC修饰后对刷状缘膜酶的降解率小于其N末端FITC修饰肽，而VPP的C末端FITC修饰后对刷状缘膜酶的降解率却大于其N末端FITC修饰肽。渥曼青霉素能显著降低RVPSL和RVPSP的N末端和C末端FITC修饰肽的吸收，却对VPP的N末端和C末端FITC修饰肽均无显

7、著影响，细胞松弛素D能显著增大RVPSL和RVPSP的N末端FITC修饰肽和VPP的N末端和C末端FITC修饰肽的吸收率，但对RVPSL和RVPSP的C末端FITC修饰肽无显著影响，说明RVPSL和RVPSP的N末端修饰肽可能是通过细胞旁路和胞吞作用两种途径被吸收，而C末端修饰肽则可能主要通过胞吞途径被吸收。但是，不同于RVPSL和RVPSP，VPP的N末端和C末端FITC修饰肽的吸收机制均为细胞旁路。另外，圆二色谱结果显示，寡肽的二级结构与其在Caco-2细胞单层膜的完整吸收无关。（4）利用氨基酸替换法人工设计了78条以Al