人剪切修复基因XPD对肝癌细胞生长抑制的研究

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1、摘要摘要目的研究表明，人剪切修复基因着色性干皮病基因D(XerodermaPigmentosumD，XPD)作为重要的DNA修复路径⋯一核苷酸切除修复中的关键因子，在DNA修复路径中起着重要的作用。XPD基因发生突变时，肿瘤易感性更高。本实验研究野生型XPD基因对肝癌细胞生长的影响，探讨XPD基因抑制肝癌细胞生长的机制。方法用碱裂解法提取空载质粒pEGFP—N2和重组质粒pEGFP—N2-XPD，提取出的质粒以删I、脚II和5：刖I酶切鉴定。实验分三组，重组质粒XPD-N2、空载质粒N2，并用与XPD—N2、N2具有相同遗传背景和

2、代数的SMMC-7721细胞作为空白对照。用脂质体转染法瞬时转染三组细胞。荧光显微镜下观察转染后绿色荧光蛋白报告基因表达情况。提取各组细胞总RNA，合成aDNA，用聚合酶链反应(PCR)检测三组细胞中XPD、c—myc、cdc25A、cdK2表达情况。使用蛋白抽提液分别提取三组细胞的总蛋白，使用全自动生化分析仪测定蛋白浓度，Westernblot法检测细胞中XPD、c-myc、cdc25A、cdK2表达量变化。流式细胞仪器检测细胞周期，分析细胞各周期的百分率。在96孔板中进行三组细胞的转染，MTT法观察细胞增殖的活力。结果1、提取

3、出的重组质粒pEGFP-N2-XPD用酶切鉴定，与Genebank中公布的人类XPD完整mRNA序列NM000400相吻合。2、转染质粒后40h，在荧光显微镜下，可以在SMMC一7721-pEGFP-N2，SMMC一7721一pEGFP—N2一XPD中观察到绿色荧光蛋白的表达。3、RT-PCR、Westernblot检测发现SMMC一7721-pEGFP—N2一XPD细胞与SMMC-7721-pEGFP-N2和SMMC-7721两对照组相比，其XPD表达明显增高；c-myc、cdc25A、cdK2相对表达量明显减少，差异有统计学意

4、义。4、流式细胞仪结果显示：与其它二组相比，转染了pEGFP-N2-XPD重组质粒的肝癌SMMC-7721细胞进入S期发生障碍，停滞在G。期。5、MTT检测示：与两对照组相比，SMMC一772卜pEGFP—N2一XPD细胞增殖率明显减弱(尺O．05)。结论野生型XPD基因可以抑制肝癌细胞的生长，XPD基因可抑制c-myc、cdc25A、cdK2基因的表达。而且野生型XPD基因也通过抑制cdK2的表达作用于II摘要S期DNA损伤检控点，从而抑制肝癌细胞增殖。关键词：肝癌，SMMC-7721细胞，XPD，C-Myc，Cdc25A，Cd

5、K2，DNA损伤检控点IIIAbstractABSTRACTobjectiveTheXerodermaPigmentosumD(XPD)geneplaysanimportantfunctioninDNArepairpath，becauseitisakeyfactorofDNAnucleotideexcisionrepair-dependentsignaling．ResearchshowsthatwhentheXPDgenemutationsinthegene，ahighersusceptibilitytotumor．Thispro

6、jectstudiedthattheXPDgenerepresseshepatomacarcinomacell(HCC)．ToinvestigatethemechanismoftheXPDgeneinhibitstheHCC．MethodspEGFP-N2andpEGFP·-N2·-XPDweretransfectedintoSMMC一7721celllinebyLipofectAMINE2000．Theexpressionofgreenfluorescentprotein(GFP)wereobservedwithfluoresc

7、encemicroscope．Theexpressionofwild—typeXPD，C—myc，cdc25A，andcdK2weredetectedbyReverseTranscription—PolymeraseChainReaction(RT-PCR)andWesternblot．Flowcytometry(FCM)wereemployedforexaminingthecellcycleofthetransfectedSMMC-7721cells．CellproliferationwasdetectedbyMTT．Resul

8、tsTherecombinationalplasmidpEGFP·-N2--XPDwasgeneratedandidentified．SMMC-7721-pEGFP-N2andSMMC一7721一pEGFP-N2一XPDexpressedthegr