逆转录病毒介导pten基因抑制人肝癌细胞系的生长

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1、逆转录病毒介导PTEN基因抑制人肝癌细胞系的生长【关键词】,肝肿瘤关键词:PTEN基因;肝肿瘤;基因转染摘要:目的研究外源性PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC的细胞周期、增殖及裸鼠致瘤能力的影响，探索肝癌基因治疗新途径.方法将携有PTEN基因的真核表达载体体外转染HHCC细胞，筛选稳定转染的细胞克隆并扩增培养，以免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况，应用流式细胞仪、电子显微镜、生长曲线测定等方法研究PTEN基因对肝癌细胞周期、超微结构、生长速率等特性的影响，并观察导入人PTEN基因对HHCC细胞裸鼠致瘤能力

2、的影响.结果稳定转染PTEN基因的HHCC肝癌细胞中PTEN蛋白稳定表达，细胞周期明显改变，细胞从G1期到S期发生抑制，细胞超微结构有退行性改变，细胞增殖活性下降70.6%裸鼠致瘤能力抑制率72.2%.结论转染外源性PTEN基因可阻止HHCC肝癌细胞由G1期进入S期，并抑制肿瘤细胞增殖.　　Keya;genetransfer　　Abstract:AIMToinvestigatethesuppressiveeffectsofex-ogenousPTENgeneonHHCChepatocellularcarcin

3、omacelllineandtoprobeneethodsofgenetherapyforhepatocel-lularcarcinoma.METHODSAeukaryoticexpressionvectorcontainingPTENgeneanHHCCcellundermediationoflipofectamine，andpositivecellclonesplified.ExpressionofPTENgenemunohistochemistry.Floetry，electronmicroscopee

4、asuretheeffectsofPTENoncellcycle，ultrastructure，andcellgroorigenicityinnudemice.RESULTSPTENmunohistochemistry.TheprogressionofcellcycleG1toSphase.parediceaticallyinhibitedby70.6%and72.2%，respec┐tively.CONCLUSIONHHCChepatomacarcinomacellscouldbearrestedatG1/

5、Sphaseandthegroine2000（Gibco）;嘌呤霉素（Clon-tech）;pBP-PTEN及pBP质粒（美国LudAb（SantaCruz）;SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）;6L・L-1的潮湿空气的条件下，培养于青、链霉素浓度均为105U・L-1的100mL・L-1小牛血清-RPMI1640培养基中.基因转染采用脂质体介导法（参照lipofectamine2000说明）将pBP-PTEN和pBP质粒分别转染入处于对数生长期的肿瘤细胞.筛选培

6、养基中嘌呤霉素浓度为0.5mg・L-1，维持筛选15d，加压筛选7d，挑选阳性细胞克隆，扩增培养.将分别成功转染pBP-PTEN和pBP质粒的HHCC细胞命名为HHCC-pBP-PTEN和HHCC-pBP细胞.未转染细胞作为阴性对照.用免疫组化方法检测PTEN蛋白在上述3种细胞中的表达情况.一抗为鼠抗人PTEN蛋白mAb，1∶100稀释，4℃过夜，加入2抗，室温孵育30min，加入SABC复合物，DAB显色，苏木素衬染.以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照.3种细胞分别经2.5g・L

7、-1胰蛋白酶消化成单细胞悬液，各取约1×106个细胞，无菌PBS洗涤细胞2遍，以预冷的无水乙醇固定后，流式细胞仪进行细胞周期检测.3种细胞各约1×106，经胰酶消化，1000r・min-1离心5min，细胞沉淀以戊二醛固定2h，常规包埋，切片，电子显微镜下观察.3种细胞经2.5g・L-1胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，接种于24孔板，每种细胞接种7孔，每孔约4×103个细胞，每日取1组细胞进行计数，绘制细胞生长曲线.取16只6L经1640培养基重悬的肿瘤细胞，细胞数量约为1×106，其

8、中实验组注射HHCC-pBP-PTEN细胞，对照组注射未转染HHCC细胞.连续观察肿瘤的生长，并测量肿瘤直径.　　统计学处理:数据以SPSS统计软件包进行t检验.　　2结果　　EcoRⅠ单酶切将含PTEN基因的pBP质粒切为约1.2kb和5.1kb的两条带，而将空pBP仅切为5.2kb的一条带.SpeⅠ和HindⅢ双酶切将pBP-PTEN切为约2.3kb和4.0kb两个片断，将空pBP切为约1.1k