doxycycline抑制人肝癌细胞系hepg2生长的实验研究

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1、Doxycycline抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研究作者：张强波　李杰　时昌文　李捷　孙京杰　曹莉莉【摘要】目的：观察多西环素（Doxycycline）对人肝细胞性肝癌细胞系HepG2生长抑制和凋亡的作用，并初步探讨其作用机制。方法：不同浓度的Doxycycline（5、10、20、30和50mg/L）对体外培养人肝癌细胞系HepG2进行不同的时间干预（24、48和72h），MTT法测定细胞生长抑制率，TUNEL法检测细胞凋亡率，免疫细胞化学检测Fas、FasL及MMP-2蛋白表达的变化。结果：Doxycycline作用HepG2细胞48h和72h后，细胞生长被

2、明显抑制，与无药对照组比较差异有统计学意义（P<0.001），且呈时间、浓度依赖趋势。其细胞凋亡率较无药对照组也明显升高（P<0.01）；20mg/LDoxycycline作用于癌细胞48h后，实验组FasL蛋白阳性表达较无药对照组明显升高，MMP-2蛋白阳性表达较无药对照组明显降低，两组差异均有统计学意义（P<0.01），而Fas蛋白表达则差异无统计学意义（P>0.05）。结论：Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2具有明显的生长抑制和促凋亡作用，其机制可能与下调MMP-2、上调FasL从而启动Fas/FasL膜受体途径有关。【关键词】肝

3、肿瘤·Doxycycline·细胞凋亡·FasL·MMP-2【ABSTRACT】Objective:ToobservetheeffectandmechanismofdoxycyclineoncellgroanhepatomacellHepG2invitro.Methods:HepG2cellseinvitro.Cellgroinedbyimmunocytochemicalstaining.Results:Treatedg·L-1）for48and72hours,thegroedependentmanner.IncubatedHepG2cellsg·L-1for48hour

4、s,theexpressionofFasLightinhibitcellgroechanismofdoxycyclineinducedapoptosismightbeassoci　　多西环素（Doxycycline）为四环素类抗生素的一种，已有研究表明其对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤生长有明显的抑制作用［1-3］，而其对人肝癌细胞的生长抑制作用国内外未见报道。本研究观察了Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2的生长抑制和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。1　材料与方法1.1　实验材料　人肝细胞性肝癌细胞系HepG2购自美国典型物保藏中心细胞库，用含10%胎牛

5、血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱内常规培养，每日倒置显微镜观察细胞生长情况，3d换液，适时0.25%胰酶消化传代。四甲基偶氮唑盐（MTT）、DMSO和Doxycycline均购自Sigma公司，TUNEL凋亡检测试剂盒购自Roche公司，FasL兔多克隆抗体及MMP-2鼠单克隆抗体购自SANTCRUZ公司，Fas鼠单克隆抗体购自北京中山公司。1.2　方法1.2.1　MTT法检测肿瘤细胞生长能力　取对数生长期HepG2细胞，配成1.5×105mL-1的单细胞悬液，96孔培养板每孔加入200μL细胞悬液约3×104细胞，细胞常规培养4h，贴壁后每

6、孔重新加入含不同浓度Doxycycline的培养液2μL，使其终质量浓度约分别为5、10、20、30和50mg/L，每个药物浓度设5个孔。同时设无药对照组5孔，无细胞培养液1孔（调零孔）。37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱内常规培养24、48和72h，分别取培养板MTT法计算药物作用后的吸光度（opticaldensity,OD）。按以下公式计算细胞生长抑制率：1.2.2　TUNEL检测细胞凋亡　取对数生长期生长良好的HepG2细胞，将其分别接种于200mL培养瓶中，细胞贴壁后更换成含终质量浓度分别为5mg/L和20mg/LDoxycycline的条件培养液作用24、48和

7、72h。胰酶消化各组细胞后，取1滴细胞悬液于已消毒载玻片上，细胞贴壁生长4h制成细胞爬片，用1∶1甲醇丙酮固定30min,保存备用。按TUNEL试剂说明书（Roche）操作，采用倒置荧光显微镜成像，随机选取5个视野300个细胞计算细胞凋亡率。1.2.3　细胞免疫组织化学法检测FasL、Fas及MMP-2蛋白的表达　应用前述方法制作细胞爬片，分别加入FasL、Fas及MMP-2一抗，用SABC法进行细胞免疫组织化学染色，DAB显色。1.3　判断标准　FasL、Fas及MMP-2蛋白定位于细胞膜和（或）细胞质，阳性反应为细胞膜和（