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《Doxycycline抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研究 .doc》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、Doxycycline抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研究 毕业论文作者:张强波李杰时昌文李捷孙京杰曹莉莉关键词肝肿瘤·Doxycycline·细胞凋亡·FasL·MMP-2 多西环素(Doxycycline)为4环素类抗生素的1种,已有研究表明其对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤生长有明显的抑制作用[1-3],而其对人肝癌细胞的生长抑制作用国内外未见报道。本研究观察了Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2的生长抑制和凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。 1材料与方法 方法 TUNEL检测细胞凋亡取对数生长期生长良好的
2、HepG2细胞,将其分别接种于200mL培养瓶中,细胞贴壁后更换成含终质量浓度分别为5mg/L和20mg/LDoxycycline的条件培养液作用24、48和72h。胰酶消化各组细胞后,取1滴细胞悬液于已消毒载玻片上,细胞贴壁生长4h制成细胞爬片,用1∶1甲醇丙酮固定30min,保存备用。按TUNEL试剂说明书(Roche)操作,采用倒置荧光显微镜成像,随机选取5个视野300个细胞计算细胞凋亡率。 判断标准FasL、Fas及MMP-2蛋白定位于细胞膜和(或)细胞质,阳性反应为细胞膜和(或)细胞质内着棕黄色颗粒。免疫组织化学结果判定参照文献
3、[4],以阳性细胞百分比及着色强度计分做半定量分析。随机观察5个高倍视野,根据阳性细胞数占细胞总数的百分比计为0~4分:无阳性细胞为0分,75%为4分;染色的深度以多数细胞的显色反应为准,着色强度计0~4分:无色为0分,淡黄色为1分,深黄色为2分,棕黄色为3分,棕褐色为4分。将上述两项指标的评分相加。每张片分别由2个观察者进行盲法测定,最后取两观察者所得平均值。 统计学处理使用统计软件,多组数据间的比较采用单因素方差分析或独立样本t检验,P [NextPage]2结果 Doxycycline对HepG2细胞凋亡的影响本研究选用5、20
4、mg/L两个药物浓度观察其对HepG2细胞凋亡的影响,在24h后各组凋亡率差异无统计学意义(P>),而在作用48、72h后各实验组细胞凋亡率较对照组明显增加,P(图5)。 3讨论 细胞凋亡是1个比较复杂的过程,可通过多条启动途径实现,其中膜受体途径(Fas/FasL)是最重要的途径之1。LiuJ等[7]发现Doxycycline可通过Fas/FasL介导的膜受体途径诱导T淋巴细胞凋亡,最近研究报道Doxycycline能够明显抑制人胰腺癌细胞增殖,并证实其主要通过Caspase依赖的细胞凋亡发挥作用[3]。有报道表明人肝癌细胞系HepG
5、2表面Fas有较强的表达[8]。本研究结果显示20mg/LDoxycycline作用HepG2细胞48h后FasL蛋白表达明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P)。提示Doxycycline可能通过上调细胞表面FasL的表达而启动Fas/FasL介导的信号传导途径诱导细胞凋亡。 药物对肿瘤的抑制作用机制往往是多方面、多途径的,同样Doxycycline通过何种途径影响细胞FasL及MMP-2表达,其具体机制尚不完全清楚,有待做更进1步的实验研究和机制探讨。但初期的体外研究得到了较理想实验结果,有望为肝癌的临床诊治寻求1种新的药物治疗。
6、参考文献[2]FifeRS,SledgeGWJr,RothBJ,etal.Effectsofdoxycyclineonhumanprostatecancercellsinvitro[J].CancerLett,1998,127(1-2):37-41.[4]刑传平,刘斌,董亮.免疫组织化学标记结果的判断方法[J].中华病理学杂志,2001,30(4):318。[6]BettanyJT,PeetNM,WolowaczRG,eta1.Tetracyclinesinduceapoptosisinosteocoasts[J].Bone,2000,27
7、(1):75—80.[8]MasatoNakamura,HiroakiNagano,SakonM,etal.RoleoftheFas/FasLpathwayincombinationtherapywithinterferon-αandfluorouracilagainsthepatocellularcarcinomainvitro[J].JournalofHepatology,2007,46(1):77-78.[9]FifeRS,RougraffBT,ProctorC,etal.Inhibitionofproliferationandind
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