TIEG1基因在TGFβ1介导肝癌细胞生长抑制中的作用及抗肿瘤研究

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1、浙江入学博‘I：学位论文中文摘要TIEGl基因在TGF．p1介导肝癌细胞生长抑制中的作用及抗肿瘤研究浙江大学医学院博士研究生导师摘要细胞生物学蒋磊李继承教授孔祥复院士第一部分TIEGl基因在TGF．1311介导肝癌细胞生长抑制中的作用研究背景：肝癌是世界上第五大恶性肿瘤，晚期患者治疗难度大、疗效差，目前尚无有效的治疗策略。因此研究肝癌的发病机制，寻找新的治疗靶点和疗法是目前研究热点。TGF．p在体外能抑制肝细胞增殖和诱导细胞凋亡，在体内控制肝细胞的生长，维持肝脏大小。然而，在肝癌细胞中，往往对TGF．p失去敏感性，被认为是

2、肝癌发病的机制之一，但其机理尚未完全阐明。研究目的：通过筛选对TGF．p1不同敏感程度的细胞株(包括正常肝细胞和肝癌细胞)，以此为模型，研究肝癌细胞对TGF．13敏感性缺失的主要原因以及TIEGl抑制肝癌细胞生长的作用机制。研究方法：选取了对TGF．D敏感的肝癌细胞株Hep3B和正常永生化的肝细胞株MIHA，以及对TGF．p不敏感的两株肝癌细胞株(HepG2、Bel7404)做为细胞模型。TGF．B1处理0、O．5、l、2、4h后，RT．PCR方法检测TGF．p不同敏感程III浙江人学博l：学位论文中文摘要度的细胞株之间T

3、GF．p信号通路主要相关基因表达的差异；利用siRNA抑制TGF．p敏感肝癌细胞Hep3B的TIEGl表达，观察细胞对TGF．91敏感性的改变；利用慢病毒载体在TGF．D不敏感肝癌细胞(HepG2、Bel7404)中过表达TIEGl，研究TIEGl在TGF．p1对肝癌细胞生长抑制中的作用。Westernblot检测TGF．91和TIEGl对stathmin表达的影响；萤光素酶报告基因检测TIEGl对stathmin启动子的调控；采用染色质免疫共沉淀方法，观察TIEGl对stathmin启动子区域的直接结合作用；并进一步在T

4、IEGl过表达的肝癌细胞中同时过表达stathmin，研究对逆转TIEGl抑制细胞生长的作用。研究结果：(1)在检测TGF．Bl处理细胞后的早期基因反应中，发现在TGF．p敏感的细胞(Hep3B、MIHA)中，TGF．B1能强烈诱导TIEGl基因表达上调(7-1l倍)，并在1h时达到高峰；而在对TGF．B不敏感的细胞(HepG2、Bel7404)中，TIEGl基因表达只有微弱的上调(2～3倍)，TGF．B敏感的细胞中TIEGl基因表达变化显著高于TGF．p不敏感的细胞。(2)应用siRNA抑制TGF—p敏感肝癌细胞Hep3

5、B中TIEGl基因表达，可以使Hep3B细胞对TGF．D1的敏感性降低。(3)在TGF．p不敏感的肝癌细胞(HepG2、Bel7404)中过表达TIEGl，可以抑制肝癌细胞的增殖和诱导凋亡。(4)TIEGl可以通过直接结合stathmin启动子区域，调控启动子活性，下调stathmin的表达；TGF．131处理敏感肝癌细胞Hep3B也可使stathmin表达下调。(5)在TIEGl过表达的肝癌细胞中同时过表达stathmin，可以明显逆转TIEGl对肝癌细胞的生长抑制作用。结论：(1)TGF．D1处理后，TIEGl基因早期

6、表达反应能力的减弱，是导致肝癌细胞对TGF．91丧失敏感性的主要原因。(2)阐明了TGF．pl对TIEGl基因及下游stathmin的调控作用，提出假设的“TGF．p1—．>TIEGl-->stathmin—->细胞增殖抑制”新的信号通路，揭示TIEGl基因在TGF—Bl介导肝癌细胞生长抑制中的重要作用。本研究为探讨肝癌发病机制，寻找新的治疗靶点提供了实验依据。IV关键词：转化生长因子131；TIEGl；Stathmin；肝癌浙江大学博J：学位论文中文摘要第二部分慢病毒载体过表达TIEGl对胰腺癌细胞生长抑制和化疗药物的增

7、敏作用研究背景：胰腺癌是目前已知的恶性程度最高的肿瘤之一。近年来，人胰腺癌的发病率和死亡率呈上升趋势，严重影响着人们的生活质量。大部分胰腺癌细胞对化疗药物耐药，导致胰腺癌预后极差。寻找更加有效的治疗方法，成为目前胰腺癌治疗的关键。TIEGl可以诱导TGF—p敏感胰腺癌细胞凋亡，抑制细胞生长，但对TGF．13不敏感胰腺癌细胞生长和化疗药物敏感性的影响尚未阐明。研究目的：研究在胰腺癌细胞中过表达TIEGl对胰腺癌细胞生长和化疗药物敏感性的影响，并探讨其作用机制。研究方法：利用慢病毒转基因系统，在胰腺癌细胞株(SWl990和Ca

8、npan．2)以及永生化正常胰腺导管细胞株(HPDE6．E6E7．c7)中过表达TIEGl，MTT法测定其对胰腺癌细胞和正常细胞生长抑制作用的差异；DAPI染色法检测TIEGl对胰腺癌细胞凋亡的影响；MTT法测定过表达TIEGl后，胰腺癌细胞对化疗药物吉西他滨敏感性的改变；实时定量PCR和Western