和厚朴酚对肝癌hepg2细胞生长抑制及凋亡的作用

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1、和厚朴酚对肝癌HepG2细胞生长抑制及凋亡的作用：顾伟,范昕建*,吴疆,张莉敏,李晓芳,牛智强【摘要】　　目的:研究和厚朴酚(honokiol)对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及诱导凋亡作用。方法:用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度和厚朴酚对HepG2细胞的增殖活性的效应,通过显微镜、荧光染色观察细胞形态学变化;DNA片段化检测细胞凋亡;流式细胞术检测和厚朴酚诱导细胞凋亡的凋亡指数(AI),caspase3、8、9活性的变化。结果:和厚朴酚浓度为40～160μmol/L时对HepG2细胞增殖有明显的抑制效应,且

2、呈剂量依赖性;细胞加入和厚朴酚诱导24h后AI明显高于未加入组(P<0.05),caspase3、8、9活性增高。结论:和厚朴酚在一定浓度范围内能明显抑制HepG2细胞的增殖并能诱导其凋亡,其作用呈浓度依赖性。它可能通过激活caspase途径诱导HepG2细胞凋亡。【关键词】和厚朴酚HepG2细胞增殖生长抑制凋亡　　传统中药厚朴被广泛使用于治疗许多疾病,和厚朴酚(honokiol)是木兰科植物厚朴(Magnoliaofficinalis)的有效成分,是一种从中药厚朴中分离出来的具有生物活性的化合物,据文献报道和厚朴

3、酚具有抗氧化、抗血栓形成、抗菌、和抗肿瘤［1-4］的作用。本研究观察了和厚朴酚对HepG2细胞增殖的影响及其诱导HepG2细胞凋亡的作用。　　1材料和方法　　1.1材料流式细胞仪(EPICSELITEESP,BeckmanCoulter),二氧化碳(CO2)培养箱(SANYO),倒置生物显微镜(Olympus),凝胶成像系统(GelDoc1000,BIORAD),24、96孔培养板(CorningIncorporated),DMEM培养基(Gibco,GrandIsland,NY,USA),小牛血清购于兰州民海生物有限公

4、司。Hoechest33258、AnnexinVFIFC细胞凋亡检测试剂盒购于凯基生物科技发展有限公司。琼脂糖,溴化乙锭(EB),甲基噻唑蓝(MTT),二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma(St.Louis,MO,USA)和厚朴酚(honokiol)标准品购于中国药品生物制品检定所,用二甲基亚砜溶解(DMSO)(终浓度<0.01%)。人肝细胞癌细胞株HepG2,来自ATCC,四川大学教育部移植免疫重点实验室细胞室保种。细胞接种在含100mL/L小牛血清的DMEM培养液中,在37℃、50mL/LCO2培养箱中培养。　

5、　1.2方法　　1.2.1MTT法检测取对数生长期人肝细胞癌细胞株HepG2,加入2.5g/L胰蛋白酶消化,吹打制成单个细胞悬液,调整细胞密度为5×103/L,以每孔体积200μL接种于96孔培养板上。培养24h,待细胞贴壁后,各孔分别加入不同浓度的和厚朴酚,每孔体积均为200μL,使和厚朴酚终浓度分别为0(对照组)、20、40、80、160μmol/L(用药组),每个浓度作3个复孔,同时点3块板。分别培养24、48、72h后,加入MTT20μL/孔,置于CO2培养箱中继续培养4h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液,每孔加

6、入DMSO150μL,充分振荡,使蓝紫色沉淀充分溶解。在30min内用酶联免疫检测仪测定570nm波长处的光吸收值A570。不同时间点不同浓度和厚朴酚对肝癌细胞的增殖抑制率=(对照组A570－用药组A570)/对照组A570×100%。　　1.2.2形态学的观察每瓶1×106个细胞的密度接种于50mL细胞培养瓶中,培养24h后加入浓度为0和40μmol/L的和厚朴酚,于24h用倒置显微镜观察。　　1.2.3荧光染色每瓶1×105个细胞的密度接种于24孔培养板中,24h后加入浓度为0和40μmol/L的和厚朴酚,培养24h,

7、细胞在24孔培养板内原位固定染色。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次,用40g/L多聚甲醛500μL室温固定15min,用PBS洗2次,弃废液,加入终浓度为10mg/L,Hoechst33258溶液500μL/孔,37℃染色10min,荧光显微镜下观察。　　1.2.4DNA片段化电泳收集1×106以上的细胞,用PBS洗2次,加入100μL细胞裂解液(10mmol/LTrisHClpH7.4,10mmol/LEDTApH8.0,5mL/LTritonX100)4℃裂解10min,25000g离心20min,收集上清液。加入4

8、0ng/LRNase,37℃孵育1h后加入40ng/L蛋白酶K,37℃孵育1h,加入20μL5mol/LNaCl和120μL异丙醇,-20℃过夜。25000g离心15min,去上清,再次25000g离心5min,去上清,用TrisEDTA(pH7.5)缓冲液溶解沉淀。用20g/L琼脂糖凝胶40V电泳,