逆转录病毒介导的靶向人slingshot1l基因的稳定转染细胞系的建立

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1、逆转录病毒介导的靶向人Slingshot1L基因的稳定转染细胞系的建立：张慕蕊王岩赵东旭李新娜李群李玉林【摘要】目的应用Slingshot(SSH)1L重组逆转录病毒载体，建立过表达该基因的稳定转染细胞系。方法用脂质体法将含SSH1L的重组逆转录病毒载体pLNCXSSH1L转染PA317包装细胞，G418筛选,滴度测定。收集病毒上清感染MG63细胞，G418筛选。结果应用pLNCXSlingshot1L重组逆转录病毒载体,获得滴度为5×108CFU/L的病毒上清，感染MG63细胞，获得了过表达SSH1L基因的MG63细胞。结论应用SSH1L重组逆转录病毒

2、载体，成功建立了过表达该基因的稳定细胞系。【关键词】逆转录病毒;稳定转染　　【Abstract】ObjectiveToestablishstabletransfectedcelllinebyretroviralvectorencodingSlingshot1L.MethodsTheplasmidpLNCXSlingshot1Line.Thetransfectantsediatedbyretroviralisestablishedsuccessfully.　　【Keyyctag)。脂质体2000购自Invitrogen公司，高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎

3、牛血清购自Hyclone公司，胰蛋白酶和EDTA购自Sigma公司，免疫组织化学试剂盒购自福州迈新公司。抗人cmyctag抗体购自博奥森生物工程有限公司，抗人Pcofilin抗体、抗人Cofilin抗体购自美国SantaCruz公司。引物hSSH1L前向：CACAAGCATGCAGGTGATCT，反向：TATGTGCATCCTTCCTGCTG(306bp);GAPDH前向:GCATCCTCACCCTGAAGTAC，反向：TGGTGCCGCCAGACAGCACT(750bp)由上海生工合成。　　1.2病毒包装及阳性克隆筛选将PA317细胞接种于6孔板中,至细胞长满约8

4、0%时用脂质体法将pLNCXSSH1L重组质粒转入PA317细胞，参考Invitrogen公司试剂盒说明书操作。转染48h后以1∶8传代，然后用含800mg/LG418和10%胎牛血清的HDMEM培养基筛选。10d后可见阳性克隆,挑选克隆，继续培养，待细胞接近完全融合时移取上清，即含有病毒的培养液。以未转染的PA317细胞作对照。　　1.3计算病毒滴度将NIH3T3细胞以1×105细胞/孔接种于6孔板中。收集病毒液，经醋酸纤维素膜滤器过滤后，制备6个系列稀释梯度的病毒液，加入6孔板，Polybrene终浓度为8μg/ml。病毒感染24h后，用含500μg/mlG41

5、8培养液筛选1l。24h后更换含500μg/mlG418培养液筛选，2l。　　1.5稳定转染细胞系的鉴定　　1.5.1用抗人cmyctag抗体对转染后的细胞进行免疫荧光测定转染和未转染的MG63细胞铺细胞爬片，待爬片上的细胞长满80%时用PBS冲洗，4%多聚甲醛室温固定30min，PBS冲洗，加过氧化物酶阻断剂,血清封闭,加一抗(抗人cmyctag抗体),4℃孵育过夜，PBS冲洗，加FITC标记的二抗，避光孵育，PI染核。胞浆中出现绿色荧光为阳性反应。　　1.5.2应用RTPCR检测SSH1L的表达情况提取转染和未转染MG63细胞的总RNA，测定纯度及含量，反转录

6、合成cDNA(RT)，PCR扩增，SSH1L反应条件为94℃2min，94℃1min、60℃30s、72℃30s33个循环，72℃7min，4℃10min，GAPDH反应条件为95℃2min、95℃30s、55℃30s、72℃30s28个循环，72℃10min，4℃10min，反应结束后，取PCR产物5μl，经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，照相记录结果。　　1.5.3in，上样量为20μl，电泳、转膜、杂交、ECL显色。　　2.3稳定转染细胞系的建立收集病毒上清，感染MG63细胞。经500μg/mlG418培养液筛选2l(图2)。　　2.4稳定转染细胞系的鉴定用cm

7、yctag抗体对转染后的细胞进行免疫荧光测定，结果显示MG63细胞感染率为90%以上(图3)。应用RTPCR检测SSH1L的表达情况，结果显示转染组较未转染组SSH1L的表达明显增强(图4)。激酶及SSH磷酸酶在细胞内惟一已知的底物。SSH由3种基因编码,每种都有长型和短型(长型以L表示)。3个SSH家族磷酸酶在亚细胞分布、与肌动蛋白丝的结合活性、特异活性和组织表达方式上有所不同，SSH1L和SSH2L与肌动蛋白丝紧密结合并共存。SSH1L，连同SSH2L和SSH3L使Cofilin去磷酸化，从而激活Cofil