逆转录病毒介导的靶向人slingshot1l基因稳定转染人骨髓间充质干细胞系的建立

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1、逆转录病毒介导的靶向人Slingshot1L基因稳定转染人骨髓间充质干细胞系的建立：张慕蕊王岩马英智赵东旭杨旭芳李玉林【摘要】目的建立过表达该基因的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)稳定转染细胞系。方法采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs。应用脂质体法将Slingshot1L重组逆转录病毒载体pLNCXSlingshot1L转染PA317包装细胞，G418筛选,滴度测定。收集病毒上清感染第2代hMSCs，G418筛选，挑选阳性克隆，扩增培养。结果采用密度梯度离心法联合贴壁培养法成功分离、纯化了hMSCs，应用pLN

2、CXSlingshot1L重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,获得滴度为5×108CFU/L的病毒上清。收集病毒上清感染hMSCs，获得了过表达Slingshot1L基因的hMSCs。结论应用Slingshot1L重组逆转录病毒载体，成功建立了过表达该基因的hMSCs稳定转染细胞系。【关键词】逆转录病毒;稳定转染;干细胞　　【Abstract】ObjectiveToestablishstabletransfectedhumanmarroesenchymalstemcells(hMSCs)linebyretroviralve

3、ctorencodingSlingshot1Ltoabtainviralsupernatantthebonemarroanbydensitygradientcentrifugationandadheringtotheculturedishes.TheplasmidpLNCXSlingshot1Line.Thetransfectantsediatedbyretroviralcells　干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，有望成为移植器官的新，然而对其向不同方向分化的机制尚不明了。研究表明，机械应力刺激可引起骨

4、髓间充质干细胞(MSCs)和成骨细胞骨架的解聚和重排，而且MSCs对机械力刺激的反应比成骨细胞更敏感〔1〕，表明细胞骨架在MSCs分化过程中可能发挥了重要作用。Slingshot(SSH)是一种特异的肌动蛋白解聚因子(Cofilin)磷酸酶，可使Cofilin去磷酸化而活化，抑制肌动蛋白丝聚合，参与对细胞骨架的重排〔2〕，表明SSHt在干细胞分化过程中可能发挥重要作用。目前国内外对SSH研究刚刚起步。本文应用SSH1L重组逆转录病毒载体，获得高滴度病毒上清，建立过表达该基因hMSCs稳定转染细胞系，为研究MSCs分化相关机制提供有力实

5、验基础。　　1材料与方法　　1.1标本18～45岁正常成人穿刺骨髓血5例，均来自健康自愿者。　　1.2主要试剂和仪器PA317及NIH3T3细胞为本实验室保存。重组逆转录病毒载体pLNCXSSH1L由王岩教授惠赠(SSH1L基因全长插入逆转录病毒载体pLNCXMCS多克隆位点，末端含有cmyctag)。高糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶和EDTA(Sigma公司)，Percoll分离液(美国Pharmia公司);CD105、CD73、CD166、CD29、CD4

6、5抗体(BDPharMingen公司或NeoMarker公司)，FITC标记二抗(Sigma公司)，抗人cmyctag抗体(博奥森生物工程有限公司)，抗人Pcofilin抗体和抗人Cofilin抗体(美国SantaCruz公司)。引物hSSH1L前向：CACAAGCATGCAGGTGATCT，反向：TATGTGCATCCTTCCTGCTG(306bp);GAPDH前向:GCATCCTCACCCTGAAGTAC，反向：TGGTGCCGCCAGACAGCACT(750bp)(上海生工合成)。　　1.3hMSCs的分离培养具体方法见文献

7、〔3〕，以P2和P4代hMSCs为实验对象。　　1.4病毒包装及阳性克隆筛选将PA317细胞接种于6孔板中，至细胞长满约80%时应用脂质体法将pLNCXSSH1L重组质粒转入PA317细胞，参考Invitrogen公司试剂盒说明书操作。转染48h后传代,用含800mg/LG418和10%胎牛血清的HDMEM培养基筛选。10d后可见阳性克隆,挑选克隆，继续培养，待细胞接近完全融合时移取上清，即含有病毒的培养液。以未转染的PA317细胞作对照。　　1.5病毒滴度测定与计算将NIH3T3细胞接种于6孔板，收集病毒液，过滤，制备6个系列稀

8、释梯度的病毒液，加入6孔板，Polybrene终浓度为8μg/ml。病毒感染24h后，用含500μg/mlG418培养液筛选1l。24h后更换含300μg/mlG418培养液筛选，2l。　　1.7稳定转染细