腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

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1、腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞：华平，陈炬，张惠忠，杨淞然，杨艳旗，熊利华，张华【摘要】　　【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、SCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数(multiplicytiesofinf

2、ection，MOI)具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率>95%，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰(1125pg/mL)，13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。【关键词】血管内皮生长因子；骨髓间充质干细胞；腺病毒；转染Abstract:【Objective】Toinvestigatetheexpressionofadenovirust

3、ransfectedvascularendothelialgroesenchymalstemcellsinvitroandtheeffectoftransfectiononMSCsproliferation.【Methods】AadenoviralvectorcontainingVEGF165geneethod.TheinfectionefficiencyofadenovirusvectortoMSCsediumeasuredbyimmunohistochemicalstaining,SCscouldbeeffectivelytransfected

4、byadenoviruscontainingVEGFgeneinvitro,thetransfectionefficiencyhasthedose-effectrelationshipultiplicytiesofinfection(multiplicytiesofinfection,MOI).OIorethan95%.TheexpressionofVEGFedium.AmaximumproductionofVEGFLattheninthday),andVEGFediatedbyadenoviralvectorcantransfectVEGFgen

5、eintoMSCsesenchymalstemcells；adenovirus；transfection血管内皮生长因子(vascularendothelialgroesenchymalstemcells，MSCs）具有取材方便、体外扩增容易、易于基因操作、适合自体移植的特点，被认为是缺血性心脏病的细胞治疗和基因治疗的重要供体细胞[2，3]。我们通过构建VEGF腺病毒载体,并转染MSCs，然后检查其在MSCs中的表达产物和表达产物的活性，同时观察转染对MSCs的生长、转化有无影响，为进一步采用VEGF进行的基因治疗和将其用于促进组织工程化心肌组织的

6、形成和再血管化提供实验和理论依据。1材料和方法1.1材料IMDM培养基购于美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)为Hyclone公司产品；Ficoll-paque分离液购于Pharmacia公司；胰蛋白酶和EDTA为Gibco公司产品；二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购于美国Sigma公司；ELISA试剂盒购于美国R(D公司；ABC免疫组化试剂盒购于博士德生物制品公司；鼠抗人VEGF抗体购于博士德生物制品公司；脂质体和细胞转染试剂盒购自Gibco公司；hVEGF165基因片断、大肠杆菌DH5α、真核表达载体pc

7、DNA3由本实验室保存。4周龄雄性SD大鼠，体质量200～250g，由中山大学动物实验中心提供。1.2方法1.2.1pcDNA3/hVEGF165腺病毒载体的构建及鉴定将hVEGF165插入pcDNA3的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点，并转化DH5α进行扩增，凝胶电泳证实hVEGF165已插入pcDNA3多克隆位点,测序证实hVEGF165无突变。1.2.2MSCs的分离和培养将SD大鼠颈椎脱臼处死后，无菌条件下取下肢长骨，显露骨髓腔，用含体积分数15％胎牛血清的IMDM培养液冲洗骨髓腔获取骨髓细胞，将冲洗液收集于离心管中，2000r/min离心

8、15min（上海医用分析仪器厂离心沉淀仪，型号LXJ-II，r=4cm），弃上清及脂肪层，取沉淀，用IMDM培养液混匀，轻