慢病毒介导hhcn4基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器实验的研究

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1、慢病毒介导的hHCN4基因体外转染骨髓间充质十细胞构建生物起搏器的实验研究中文摘要慢病毒介导hHCN4基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器的实验研究中文摘要实验背景：在过去的70年中，电子起搏器在心脏传导阻滞性疾病(病窦综合征、房室传导阻滞等)及顽固性心力衰竭、心室颤动等的治疗方面拯救了大量患者的生命。但是它也逐渐暴露出一些缺点：电池寿命有限(8,-一10年)、非生理性顺序激动、一些难以避免的并发症(感染、出血、心肌穿孔、电极脱位)等等。从心脏的生理功能和人体适应性的角度，理想的起搏器应该是“生物起搏器’’。现有的生物起搏方法主要包括基因生物起

2、搏及细胞生物起搏。前者主要集中在3个基因治疗策略上：①上调心肌细胞膜上的f12肾上腺素能受体表达；②抑制Kir2基因家族编码内向整流电流Il【l通道；③上调心肌细胞起搏电流的a(HCN2)和fl(MiRPI)亚单位基因。但目前这些研究尚未取得突破性进展，且上述生物起搏靶基因也不是窦房结细胞自动去极化的特异性调控基因。大量研究表明，由超极化激活的环核苷酸门控通道基因超家族编码的起搏电流(If)，在窦房结起搏细胞舒张期自动除极化过程中发挥着至关重要的作用。If通道家族共有4个成员，即HCNl"--，HCN4，其中HCN4在窦房结中表达最高，是调控If电流

3、及维持窦房结起搏细胞电生理功能的特异性基因，是一种理想的生物起搏靶基因。骨髓问充质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能及其对外源基因的高转染效率和高效稳定表达，不少学者利用MSCs的上述特性将其作为基因转染的细胞平台，导入目的片段基因，把细胞工程和基因治疗进行有机结合。例如，将mHCN2转染到骨髓间充质干细胞，发现MSCs能产生高水平的类似If的电流；将转染了mHCN2起搏基因的MSCs进行体内移植，可明显提高心室的“自律性"。但是HCN2亚型的生理功能在于稳定静息状态下起搏细胞的舒张期膜电位，从而起到稳定起搏节律的作用，而对于运动和交感刺激状态下的节

4、律稳定性则无明显影响；而HCN4不仅慢病毒介导的hHCN4基因体外转染骨髓间充质十细胞构建生物起搏器的实验研究中文摘要对产生正常起搏电位和基础心率至关重要，而且也参与交感神经对心率的调节作用。研究目的：我们设想以hHCN4为生物起搏的靶基因，应用猪骨髓间充质干细胞(MSCs)作为细胞生物起搏的平台，通过慢病毒载体转染以获取稳定高表达hHCN4基因的MSCs，并对转染细胞的起搏通道蛋白的表达及If电流动力学特性进行检测，为建立新型有效的细胞生物起搏治疗奠定实验基础。研究方法：1．猪间充质干细胞的分离与纯化采用密度梯度离心法分离纯化猪骨髓间充质干细胞，培

5、养采用直接贴壁法培养；用倒置显微镜进行活细胞形态学的动态观察。2．慢病毒hHCN4基因转染MSCshHCN4慢病毒载体(Lentiv．EGFP．hnCN4)和不含hHCN4的慢病毒对照载体(Lentiv．EGFP)对第2代MSCs进行转染。荧光显微镜观察绿色免疫荧光蛋白表达情况；免疫组化染色检测hHCN4蛋白表达情况；3．Westernblot印迹检测hHCN4转染MSCs各组的hHCN4通道蛋白表达情况；4．全细胞膜片钳技术对重组hHCN4通道进行动力学测定。研究结果：1．倒置显微镜可见，经原代培养的MSCs多数为成纤维样的梭形细胞，呈克隆样生长；

6、2．成功将hHCN4慢病毒载体(Lentiv．EGFP．hHCN4)和不含hHCN4的慢病毒对照载体(Lentiv．EGFP)转染至猪MSCs，获得了稳定表达hHCN4基因的MSCs。3．荧光显微镜可见，两组绿色荧光蛋白表达及分布无明显差异，转染效率约为40"-'50％。4．转染后免疫细胞化学染色可见，hHCN4组细胞hHCN4抗体染色为阳性，GFP组及对照组细胞则呈弱阳性；5．Westernblot印迹检测可见hHCN4组有一条约150kDa的条带，而GFP组及对照组条带不明显；II慢病毒介导的hHCN4基因体外转染骨髓问充质千细胞构建生物起搏器的

7、实验研究中文摘要6．全细胞膜片钳技术记录到lHcN4，得到电流密度．电压曲线，其激活电压约为．75mV，此电流可以被4mmol／LCsCI阻断。GFP组和对照组的MSCs细胞均无IHCN4。结论：1．密度梯度离心法可以成功分离纯化猪骨髓间充质干细胞。2．以hHCN4作为生物起搏的靶基因，通过慢病毒载体可以成功转染MSCs，并表达通道蛋白。3．转染后的MSCs表达的hHCN4通道与生理性起搏离子流通道具有相同的动力学特性。关键词：猪；间充质干细胞；慢病毒；基因转染；超级活化的环核苷酸门控通道亚型4111作者：李晓刚指导教师：杨向军慢病毒介导的hHCN4

8、基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器的实验研究abstractBonemarrowmesenchyma