tritonx-100促进脂质体介导基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及毒性的实验研究

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1、中图分类号：R89；R36；R39硕士学位论文TritonX-100促进脂质体介导基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及毒性的实验研究（小二号黑体，加黑，居中）院（系）、所口腔医学院研究生姓名黄铭珂学科、专业口腔临床医学导师姓名夏德林教授（小三号宋体，加黑）（四号宋体，加黑）1二Ο一三年四月（小三号黑体，加黑，居中）目录（三号黑体，居中）TritonX-100促进脂质体介导基因转染大鼠骨髓间充质干细胞1及毒性的实验研究……………………………………………11.1中文摘要………………………………………………

2、………11.2英文摘要………………………………………………………31.3前言……………………………………………………………51.4材料与方法……………………………………………………71.5结果……………………………………………………………121.6讨论……………………………………………………………241.7结论……………………………………………………………301.8参考文献………………………………………………………311.9英汉缩略词对照表……………………………………………352致谢………………

3、……………………………………………36颌骨缺损修复重建的研究进展（综述）……………………393（四号宋体）2TritonX-100促进脂质体介导基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及毒性的实验研究摘要目的：探讨TritonX-100促进脂质体介导基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的作用及TritonX-100对大鼠骨髓间充质干细胞活性的影响。方法：1、Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的原代取材和传代培养。2、用质粒转化DH5α大肠杆菌的方法扩增构建好的质粒pegfp-BMP2-N1，pegfp-V

4、EGF165-N1。3、通过噻唑蓝MTT法，在酶联免疫检测仪上测得492nm波长处的吸光度(OD)值，确定TritonX-100用于促进脂质体介导基因转染的最佳浓度。4、在TritonX-100适宜浓度下，脂质体介导BMP2与VEGF转染骨髓间充质干细胞。实验分7组，细胞空白组、BMP2常规转染组、VEGF常规转染组、BMP2实验组、VEGF实验组、BMP2无脂质体组、VEGF无脂质体组。细胞空白组为骨髓间充质干细胞，只含无血清培养基；BMP2与VEGF常规转染组，按Lipofect2000使用

5、说明书上的步骤进行转染；VEGF与BMP2实验组，在脂质体复合物滴加到培养孔中混匀后，加入适宜浓度的X-100混匀，其余步骤同常规转染组；BMP2与VEGF无脂质体组，不加脂质体Lipofect2000，只加入适宜浓度的TritonX-100和无血清培养基。5、在转染48小时后，用倒置荧光显微镜观察实验组及对照组中荧光蛋白的表达情况。6、转染72h后，做实时荧光定量PCR，主要检测各组中BMP2和VEGF165在转染72h后表达水平的相对差3－△△Ct异。本试验采用相对定量2法来检验基因的表达变

6、化。7、实验数据常规进行方差齐性检验、正态性检验。采用t检验比较单变量两组资料，单因素方差分析比较多组资料，非参数检验比较方差不齐者，计数资料采用卡方检验，以P<0．05为差别有统计学意义。采用SPSSl2.0统计软件处理分析。结果：1、TritonX-100用于促进脂质体介导基因转染的最佳浓度为0.005%，经MTT法测得的OD值为0.145，与空白细胞OD值0.151相比，P<0.05，无统计学意义，说明在这个浓度下，TritonX-100对细胞的生长没有影响。2、转染转染48h后，在置荧光

7、显微镜下观察到BMP2、VEGF常规转染组和BMP2、VEGF实验组有荧光表达，而细胞空白组和BMP2、VEGF无脂质体组无荧光蛋白的表达，肉眼观察下，常规转染组与实验组的荧光表达的数量有差别。3、BMP2、VEGF常规转染组和BMP2、VEGF实验组于转染后第3天，实验组BMP2的相对表达量5.94，常规转染组为4.99，其转染效率提高了19%；实验组VEGF的相对表达量3.48，常规转染组为2.77，其转染效率提高了25.6%。实验组与常规转染组的BMP2与VEGF表达水平有差异，P<0.0

8、5。结论：1、TritonX-100可以促进脂质体介导基因转染大鼠骨髓间充质干细胞，提高其19%-25.6%的转染效率。2、TritonX-100用于促进脂质体介导基因转染的最适浓度为0.005%，在这个浓度下，TritonX-100对细胞的生长没有影响。3、TritonX-100促进脂质体介导基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的原因可能是因为TritonX-100有溶解脂质体与细胞膜上的脂类物质的能力，从而促进脂质体-DNA复合物被细胞内吞或直接因膜之间的融合4而转染进细胞。关键词：TritonX-