基因抑制对细胞生长和增殖的影响

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1、第五部分POLD1基因表达受到抑制后对MCF-7细胞的生长及周期的影响实验方法Trizol提取MCF-7细胞总RNA反义POLD1表达重组质粒pXJ41-as-POLD1的构建及鉴定细胞转染及稳定表达细胞株的筛选细胞生长曲线实验血清依赖性实验单细胞克隆形成实验软琼脂集落形成实验胸腺嘧啶核苷（TdR）双阻断法同步化MCF-7细胞流式细胞光度术（FCM）进行细胞周期分析Westernblot鉴定转染细胞中特异性蛋白的表达反义RNA反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子,也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能

2、翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。近年来通过人工合成反义RNA的基因,并将其导入细胞内转录成反义RNA,即能抑制某特定基因的表达,阻断该基因的功能,有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。结果与讨论生长曲线的测定血清依赖性实验结果单细胞克隆形成率的比较软琼脂集落形成比较TdR双阻断细胞后，流式细胞光度术（FCM）观察转染细胞周期的变化Westernblot检测转染细胞中周期相关基因的表达引物设计上游：5’ATGTTTGGGTACCACGGGCAC3’631gctcc

3、cgagagagcatgtttgggtaccacgggcacggcccctccccgttcctgcgcatca下游：5’CCAGGAATTCGAATGTTTGTA3’KpnIEcoRI1261ttccgtacctcatctctcgggcccagaccctcaaggtacaaacattccctttcctgggccpXJ41-as-POLD1重组质粒图谱生长曲线的测定转染细胞的血清依赖性实验单细胞克隆形成率的比较1:MCF-as-POLD12:MCF-73:MCF-pXJ41软琼脂集落形成比较1:MCF-as-POLD1

4、2:MCF-73:MCF-pXJ41TdR双阻断细胞后，流式细胞光度术（FCM）观察转染细胞周期的变化Con145G1SG2/MG1SG2/MG1SG2/MG1SG2/MA66.822.910.30.299.70.15.790.34.04.242.453.4B59.831.78.52.893.93.31.895.62.53.083.013.96101112G1SG2/MG1SG2/MG1SG2/MG1SG2/MA8.517.574.559.57.033.484.04.811.283.17.79.1B11.665.22

5、3.35.722.971.433.113.953.140.013.546.613151820G1SG2/MG1SG2/MG1SG2/MG1SG2/MA88.05.46.689.58.02.541.351.67.126.462.111.5B70.110.019.977.912.39.882.59.97.770.824.64.622242628G1SG2/MG1SG2/MG1SG2/MG1SG2/MA16.475.08.613.464.622.052.517.130.458.015.526.5B27.764.97.320

6、.074.45.719.160.720.221.652.725.7Westernblot检测转染细胞中周期相关基因的表达123A:CyclinEB:CDK2C:CyclinD1D:CDK4E:α－Tublin1:MCF-as-POLD12:MCF-73:MCF-pXJ41ABCDE