sirna抑制stgc3基因表达对nih3t3细胞增殖的影响

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1、siRNA抑制STGC3基因表达对NIH3T3细胞增殖的影响硕士研究生：廖银花指导教师：贺修胜教授中文摘要目的：STGC3基因是新近克隆的一个候选抑瘤基因。本研究以STGC3基因阳性表达的鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞为模型，采用siRNA技术，使NIH3T3细胞的STGC3基因表达下调，观察STGC3基因表达下调对NIH3T3细胞增殖的影响。方法：构建了针对STGC3基因mRNA的pSilencer3．1-STGC3一siRNA表达载体，经脂质体转染，导入NIH3T3细胞，G418筛选，建立稳定的pSilencer3．1．STGC3一siRNA／NIH3T

2、3细胞系。RT-PCR、Westernblotting和免疫细胞化学方法，检测STGC3基因mRNA和蛋白表达。通过HE染色、绘制生长曲线、软琼脂集落形成实验及流式细胞仪分析，观察STGC3基因表达下调后，NIH3T3细胞形态、增殖速度、克隆形成率和细胞周期分布变化。结果：重组质粒DNA经酶切和测序鉴定，结果均证实pSilencer3．1-STGC3一siRNA表达载体构建成功。将pSilencer3．1-STGC3．siRNA和pSilencer3．1质粒分别转染NIH3T3细胞，G418筛选阳性细胞克隆，经RT-PCR、Westemblotting及免疫

3、细胞化学方法检测结果表明，成功建立了STGC3基因表达下调的NIH3T3细胞系。普通光学显微镜下观察，pSilencer3．1-STGC3一siRNA／NIH3T3细胞与两对照组相比，核染色加深，细胞变得细长；细胞生长曲线结果显示：pSilencer3．1-STGC3-siRNA／NIH3T3细胞较pSilencer3．1／NIH3T3细胞和NIH3T3细胞生长速度快(P

4、4+1．O)％、(2．2+0．3)％和(2．1+0．3y％，4pSilencer3．1一STGC3．siRNA／NIH3T3组克隆形成能力较两对照组显著增强(P<0．05)；流式细胞仪检测结果：pSilencer3．1一STGC3一siRNA／NIH3T3组较对照组细胞群体中处于S期和G2的细胞数目增加，Go／Gl期细胞数目减少。结论：1．构建了pSilencer3．1-STGC3一siRNA真核表达载体。2．建立了STGC3基因表达下调的pSilencer3．1．STGC3．siRNA／NIH3T3细胞系。3．siRNA抑制STGC3基因表达可促进NIH3

5、T3细胞增殖。关键词：小干扰RNA，STGC3基因，NIH3T3细胞，细胞增殖5EffectofSTGC3．siRNAontheGrowthinNIH3T3CellLineAbstractObjective：STGC3geneisacandidatetumorsuppressorgeneclonedrecently．NIH3T3celllinewasselectedas．atargetwithpositiveexpressionofSTGC3geneandobservedtheproliferationeffectafterSTGC3geneexpressi

6、oninhibitedbysiRNA．Methods：pSilencer3．1-STGC3-siRNAexpressionvectortargettingSTGC3geneWasconstructedandtransfectedintoNIH3T3celllinebycationicliposome．ThestablepSilencer3．1-STGC3-siRNA／NIH3T3celllineWasobtainedbyG418selection．ThelevelsofSTGC3mRNAandproteinweredetectedbyRT-PCR，weste

7、rnblottingandimmunohistochemistry．Cellmorphology,growthcurves，colonyformationrateandcellcycledistributionweredetectedinNIH3T3celllineafterSTGC3geneexpressiondown—regulated．Results：TheresultsofrestrictionenzymecuttingandDNAsequencingdemonstratethatthepSilencer3．1一STGC3一siRNAexpressi

8、onvectorWassuccessfullycon