tfpi-2基因对人肝癌细胞抑制作用的体内外实验研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文TFPI--2基因对人肝癌细胞抑制作用的体内外实验研究姓名：秦晓林申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：涂植光；徐勇201205型塑壁塑堕塑喧笪燮邛PI-2对人肝癌细胞抑制作用的体内外实验研究摘要目的：探讨组织因子途径抑制物2(TFPI．2)基因对人肝癌细胞H印3B生长增殖、凋亡及甲胎蛋白AFP表达的影响；以及对H印3B人肝癌细胞株裸鼠皮下移植瘤生长以及肿瘤血管生成的作用。旆第一阶段：将重组质粒pcDINA3．1一TFPI一2转染H印3B细胞并经G418筛选出稳定表达TFPI一2细胞株，

2、RT-PCR和westemblot检测转染前后TFPI．2mRNA和蛋白表达水平；第二阶段：体外实验，采用C吸．8法、绘制细胞增殖曲线观察TFPI．2对人肝癌细胞H印3B生长增殖的影响，通过平板克隆形成实验观察单个细胞的增殖能力，IH-PCR检测甲胎蛋白(AFP)1nRNA的表达，并用电化学发光法测定培养上清液中AFP含量，流式细胞仪检测细胞早晚期凋亡情况；第三阶段：体内实验，将H印3B稳定表达TFPI．2细胞株及未转染Hep3B细胞分别接种于裸鼠皮下，待皮下成瘤后，每隔3天测量一次肿瘤大小，并绘制出肿瘤体内生长曲线。3

3、周后处死裸鼠，测定肿瘤体积，提取组织中总RNA和蛋白，实时定量qI珂-PCR检测肿瘤组织TFPI．2和ⅦGFmRNA水平；Westemblot检测肿瘤组织TFPI．2和ⅥⅪF蛋白表达量：免疫组织化学法检测肿瘤组织中TFPI．2蛋白表达量和肿瘤微血管密度(m)。结果：体外实验显示，转染成功的H印3B细胞检测到TFPI-2mR_NA翼塑瞪塑堕塑堕笪燮和蛋白的表达；与转染空载体和未转染的细胞相比，转染ⅡPI．2的细胞生长增殖能力明显降低；AFPII承NA表达抑制率为16．51％，AFP蛋白分泌明显低于对照组(P

4、式细胞术检测转染TFPI．2的H印3B细胞早期凋亡率明显增加(24．03％土7．28％Vs8．77％土3．66％)。移植瘤实验显示，H印3B．TFPI．2组最终瘤体大小明显小于H印3B—V组和Hep3B—P组(P

5、I．2组m计数明显低于其余两组(P

6、FTFPI-20INHUMANHEP筮IDCARC矾OMLACELLS矾VlTRoANDobjective：ToiIlVestigatetheefIfectsoftissuefactorpathwayinhibitor_2

7、(TFPI一2)geneonmepr01iferation，apoptosisa11dexpressionofalphafetoproteinofhepatocarcinomacelllineHep3B．Furmermore，toinVesdgateⅡ1eiIlllibito巧e圩ectsofTFPI一2onthe伊ow吐lmda119iogenesisofhumanh印atocarcinomacenHep3BsubcutaIleousxenograRtumorsiIlnudemiceMethOds：Therecombi

8、nantvectorofpcDNA3．1一TFPI一2wastransfected缸oHep3BceⅡs谢thliposome，a11dmeceⅡswereselectedbyG418．TheexpressionsofTFPI一2mRNAandproteiIlweredetectedbyRT．PCRaIldWestemblotrespectively．TheinnuenceofTFPI-2ontheproliferationofHep3Bcells访agrowthcurVewasassayedbyCCK-8method．

9、Thecolony-fo衄ing眦itassay、VasusedtomeasuresiIlglecenself-replicationability．TheexpressionofAFPmRNAwasdetectedbyRT．PCRandtheAFPsecretionofHep3Bcellwasmeasuredbye