tip30基因抑制人肝癌细胞转移的实验研究

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1、TIP30基因抑制人肝癌细胞转移的实验研究福州总医院2006年12月第13卷第4期?197??实验研究?TIP30基因抑制人肝癌细胞转移的实验研究张霞赵健欧阳学农吴孟超肿瘤转移是恶性细胞与宿主防御系统问相互作用的最终结果.这种复杂的过程包括血管形成【1】,肿瘤细胞从原发组织脱落,迁移,侵袭细胞外基质并进入血管,随血液循环至远处器官,粘附,游出血管,并在靶组织停留,生长【21.关于肝癌的侵袭和转移有许多报道揭示了可能存在的分子机制,包括p53/CDKN2的突变【引,CD44v6E'】的过表达;金属蛋白酶一9E】和CD24的高表达;染色体8p的缺失等[71都与肝癌的转移有关.但转移并不是一种基

2、因发生变化而导致的,可能是由多基因构成的分子网络调控的结果.TIP30/CC~基因首先是在比较高转移性和低转移性小细胞肺癌细胞系时发现的【引.它能显着抑制变异性高转移小细胞肺癌(v—SCLC)细胞在SCID—hu—FL(Jk胚肺一联合免疫缺陷鼠移植物)动物模型中的转移力.是一种潜在的转移抑制基因.但TItB0基因在肿瘤转移中的确切作用,参与了哪些过程以及分子机制如何目前不很明确.本课题我们初步探索了TIP30基因对高转移性肝癌细胞侵袭和转移能力的影响.并初步探讨了其可能存在的分子机制,现做如下报道.l材料与方法1.1主要试剂高转移性肝癌细胞系HCC-LM3,高糖DMEM培养液(PAAI.L

3、aboratoriesGrabH.Linz.Austria)由复旦大学附属中山医院肝癌研究所汤钊猷院士惠赠;TIP30基因,腺病毒载体及其它试剂参见文献【引.1.2方法1.2.1Westernblot鉴定HCC—LM3细胞中内源性和外源性TItB0基因的表达5×10的HCC—LM3细胞接种于6孔培养板.细胞贴壁后分别用30MOI的Ad—TIP30病毒及对照病毒Ad—GFP感染细胞顺毒感染方法参见文献【),48h后提取细胞总蛋白并行westtemablot鉴定TIP30蛋白的表达.1.2.2细胞生长曲线绘制取生长良好的HCC—LM3细胞,2×10'个/孔传代至24孔培养板.病毒组分别于次日感

4、染30MOI的病毒.置37℃,5%o32孵箱培养;病毒感染第2天始用台盼蓝染色记数细胞,每日计数4孔,连续6天,第3天给未消化细作者单位:1.福州总医院肿瘤科2.第二军医大学东方肝胆外科医院胞换液.取平均值绘成生长曲线【9】.1.2.3双层琼脂克隆形成实验取生长良好的HCC—LM3细胞.分别感染30MOI的Ad—TIP30病毒和对照病毒Ad—GFP.参照文献[10】,将5×10'的细胞接种于含10%胎牛血清,下层浓度为0.53%,上层浓度为0.4%的琼脂中,孵箱中培养10～14天观察细胞集落.细胞接种数每平方厘米不超过35个,6cm平皿中约1000个.1.2.4细胞侵袭力测定实验【"】按照

5、厂商说明,用10%的冰醋酸溶解染色细胞(每孔加100—200ul的冰醋酸),将染液/溶解物混合物转移至96孔板,酶标仪测560rim吸光度值.1.2.5实验分组及处理将5×10细胞/0.2ml剂量接种裸鼠皮下【,待20只裸鼠皮下肿瘤长至最大直径约6--8ram时,随机分为3组:Ad—TItB0组(7只),Ad—GFP病毒对照组(7只)和PBS空白对照组(6只).取100ul滴度为1×10pfu/wa的Ad—TIP30和Ad—GFP病毒.消毒裸鼠肩背部肿瘤处皮肤,将病毒多点注射到瘤体内.隔天1次.共5次.空白对照组瘤体内注射等体积的PBS.每天观察动物1～2次.注意观察裸鼠的精神状态,饮食,

6、腹泻,测量体重.注射病毒后第3天始每7大1次用游标卡尺测量肿瘤大小.1.2.6组织标本取材及病理学检查皮下接种细胞后6周左右大部分裸鼠出现恶液质表现时,脱颈处死裸鼠,剥离皮下肿瘤,用10%福尔马林固定,同时剖开裸鼠胸腔,从主支气管离断并游离出整个肺脏.一半用Boyin液固定以计数肺表面转移壮的个数.一半用10%福尔马林固定作病理学检查用.剖开腹腔,观察肝脏,腹壁,隔肌腹面,肠系膜等各脏器的转移灶并计数,固定后常规HE染色检测转移灶[12】.1.3统计学处理利用statisticalanaly~software(SAS)6.12,t检验,卡方检验,单因素方差分析.2结果2.1感染Ad—TIP

7、30后HCC—LM3细胞生长曲线感染病毒后观察6天,计数细胞绘制出生长曲线.转入TItB0基因后,HCC—LM3细胞的增殖从第3天始明显减慢,与对照两组比细胞数少(P<0.05),至第6大感染Ad—TIP30病毒的HCC—LM3活细胞数为对照的70%左?198?右.2.2双层软琼脂克隆形成实验HCC—LM3细胞感染30MOI的病毒后24h接种于双层琼脂中.14天后5X低倍显微镜下随机选择3个视野计数克隆数.未感染病