青蒿琥脂对骨髓细胞株RPMI8226增殖、凋亡、侵袭影响的研究

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1、中文摘要青蒿琥脂对骨髓瘤细胞株RPMl8226增殖、凋亡、侵袭影响的研究摘要目的：多发性骨髓瘤(Multiplemyeloma．MM)是浆细胞呈恶性克隆增殖性肿瘤。多发性骨髓瘤约占所有恶性疾病的1％，血液系统恶性疾病的10％。患者多为老年人，男性的平均发病年龄为69岁，女性的平均发病年龄为71岁，只有不到5％的病人发病年龄小于40岁。在过去的30年中，85岁以上的多发性骨髓瘤的病例增加(与1968年相比，85岁以上的多发性骨髓瘤的患者已经增长了45％)，多发性骨髓瘤的死亡率也有所增加。鉴于我国目前的实际情况，大多数患者由于经济方面和观念方面的原因，不能接受治疗效果较好的自体造血干细

2、胞移植，许多病人也负担不起蛋白酶体抑制剂硼替佐米的高额费用。青蒿琥脂是一类高效、低毒的抗疟药物，并且副作用较小。近期许多学者的研究发现青蒿琥脂亦具有抗肿瘤活性。因此，在本研究中，我们进一步研究青蒿琥脂对人骨髓瘤细胞系RPMI8226的增殖、凋亡、侵袭的影响，探讨青蒿琥脂的抗骨髓瘤机制，以求为众多老年多发性骨髓瘤患者提供更合适的治疗选择。方法：1．1细胞培养：RPMl8226细胞常规用RPMI1640培养液培养。培养液内含lO％胎生牛血清(FBS)、10099／mL青霉素、100U／mL链霉素和2mmol／L谷氨酰胺。置37℃、5％C02饱和环境下培养、传代，细胞呈70％．80％融合

3、状态后换液。待中文摘要细胞进入对数生长期后进行相关实验。1．2细胞增殖抑制实验：测定2．5Ltg／ml、12．5I．tg／ml、25I-tg／ml、50pg／ml青蒿琥脂对RPMI8226细胞作用48小时的增殖抑制率。以RPMll640为空白药物对照组，培养48小时后，MTT实验检验增殖抑制，SAS8．0软件统计两者的药效区别。抑制率(％)=(对照组A值．实验组A值)／对照组A值×100％。1．3细胞形态学观察：分别在倒置显微镜下观察终浓度为25pg／ml、50pg／ml的青蒿琥脂作用48h的RPMl8226细胞，同时设立不加青蒿琥脂的空白对照组，观察细胞的数量及形态学变化。1．4

4、AnnexinV／PI双染检测细胞凋亡率：收集终浓度为Opg／ml，25pg／ml、50pg／ml的青蒿琥脂干预后的RPMl8226细胞24h后，1×PBS洗涤2次后加入500pL的BindingBuffer悬浮细胞，加入lOI．tLAnnexinV-FITC和5止碘化丙啶(PI)，室温下避光、反应15min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。1．5流式细胞术检测细胞周期分布：取对数生长期RPMl8226细胞，加入终浓度为OI_tg／ml、25pg／ml、50pg／ml的青蒿琥脂作用于RPMl8226细胞，48h后收集细胞，PBS洗后用70％乙醇4℃固定细胞，PBS再洗后加入RNA酶，10

5、分钟后用终浓度为50u∥ml的PI染色30min。流式细胞仪测定细胞周期分布，计算细胞周期变化。1．6transwell法检测青蒿琥脂对RPMl8226细胞体外侵袭能力的影响。1．7酶标仪检测caspase3／7酶活性：将RPMl8226细胞接种于96孔板上。不同实验组的培养液中分别加入终浓度为O¨∥ml、25pg／ml、50}tg／ml的青蒿琥脂。在37℃、5％C02中文摘要的条件下培养12h后，加入100p1caspase3／7试剂，3h后用酶标仪检测各组细胞在405nm处的吸光度(A值)。结果：2．1青蒿琥脂对RPMl8226细胞产生增殖抑制作用，并呈现剂量依赖性，不同浓度的

6、青蒿琥脂处理组间的A值相比较，P<0．05。随着浓度的增加，青蒿琥脂对RPMl8226细胞的增殖抑制率由33．55％增加到74．71％。48h的青蒿琥脂的IC50为36．47u∥ml(LOGIT法计算)。2．2青蒿琥酯对RPMl8226细胞形态学变化的影响25}tg／ml、50pg／ml的青蒿琥脂处理RPMl8226细胞48h后，在倒置显微镜下观察发现RPMl8226细胞数明显减少、细胞体积缩小、细胞碎裂等改变；而对照组细胞数量多、细胞核较大、胞浆丰富。2．3青蒿琥酯对RPMl8226细胞凋亡的影响AnnexinV／PI双染检测法检测细胞凋亡率结果显示，终浓度为Opg／ml、25¨

7、∥1111、501xg／ml的青蒿琥酯作用于RPMl8226细胞24h后细胞，细胞凋亡率呈剂量依赖性增加。终浓度为50p∥ml的青蒿琥酯诱导RPMl8226细胞凋亡的作用最明显，凋亡率最高可达68．1％±5．9，明显高于对照组。2．4青蒿琥脂对RPMl8226细胞周期分布的影响Ol上g／ml、25}tg／ml、50}tg／ml青蒿琥酯对RPMI8226细胞作用48小时后，流式细胞仪检测细胞周期变化的结果显示，随青蒿琥酯浓度增加，细胞G0／G1期比例逐渐减少，G2／M期