体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法

《体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法【摘要】　　目的：研究体外构建组织工程角膜基质的方法。方法：用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理猪角膜基质,在去细胞猪角膜基质材料上接种体外培养的兔角膜基质细胞，并将兔角膜基质细胞进行PKH26荧光标记，在体外构建组织工程角膜基质。用倒置荧光显微镜；HE染色光学显微镜；扫描电镜观察。结果：利用异种去细胞角膜基质组织为支架材料而构建的组织工程角膜基质具有近似正常角膜基质的三维立体结构。结论：以去细胞猪角膜基质材料为支架，利用组织工程技术可成功的在体外构建出含细胞的组织工程角膜基质组织。【关键词】组织工程　角膜基质　构建　　Invitroconstruc

2、tionofcellulartissueengineeringcornealstromaAbstractAIM:Tostudytheinvitroconstructionprocessofcellulartissueengineeringcorneastroma.METHODS:Porcinecorneastromatawereprocessedbyserialdigestionoftrypsin,DnaseandRnase.Thenrabbitcornealstromacellswereraisedinit,markedbyfluorchromepkh26.Tissueengi

3、neeringcorneastromatawereconstructedinvitro.Invertedfluorescencemicroscope,HEstaininglightmicroscopeandscanningelectron7microscopewereusedintheobservation.RESULTS:Invitroconstructedtissueengineeringcorneastromahadthesimilarthreediamensionconstructionwiththenormalcornealstroma.Conclusion:Acell

4、ularporcinecorneastromamaterialscanbeusedascarriermaterialtoconstructtissueengineeringcorneainvitro.·KEYWORDS:tissueengineering;cornealstroma;construction　　0引言角膜供体的匮乏限制了角膜移植的广泛开展，构建工程化角膜来替代供体角膜材料，为临床提供更丰富的移植材料是目前组织工程角膜研究的热点。如何构建组织工程角膜基质[1]是重要的一环。基质层是构成角膜的主要部分，占角膜厚度的90％，主要由胶原纤维、角膜基质细胞和细胞外基质组成。

5、在板层角膜移植手术中供体角膜基质层对病理转归发挥了主要的作用[2]，故体外构建工程化角膜基质具有重要的临床应用价值。1材料和方法71.1材料取新鲜的York猪全层角膜。用Tris-EDTA（10mmmol/LTris，5mmmol/LEDTA）过夜后，10g/L去垢剂Triton40C再过夜。2.5g/L胰酶37℃消化4h后，再用1∶1000的DNA酶-RNA酶37℃消化4h脱细胞处理，10g/LTriton过夜。50mmol/LTris-EDTA、三蒸水震荡清洗3遍，将全层角膜片切分为0.2mm厚的板层角膜片。-20℃冻干。Co60照射灭菌-20℃保存。取1mo龄的新西兰幼兔的

6、新鲜角膜，用含二抗的PBS液仔细冲洗，5min×3次。再将角膜全层剪下，去除虹膜组织、角膜上皮、内皮层，用含二抗的PBS液再次冲洗，5min×3次。将角膜组织剪成1mm3的组织碎块，加入胶原酶625ku/L消化30～60min后，终止消化，离心，弃上清液，加入DMEM培养液并接种于培养瓶中，放置37℃孵箱内培养，每3d换液1次。待细胞汇合后，将原代培养的角膜基质细胞用胰蛋白酶消化后吹打成细胞悬液，种植在盖玻片上，加入DMEM培养液1mL放置于孵箱中孵育24~48h，使细胞长满玻片后丙酮固定15min，将固定好的细胞爬片用0.01mol/LPBS缓冲液洗3次，每次5min；2.5m

7、L/LTritonX-100处理10min；PBS震洗3次，每次5min；30ml/LH2O2封闭内原性过氧化物酶10min；PBS震洗3次；滴加一抗，Ck（1:150），Vim（1:50），同时设空白对照，PBS代替一抗；37℃，150min；以下操作按免疫组化试剂盒要求进行。滴加DAB室温下显色5~10min，PBS冲洗终止显色反应。逐级脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。将第3代兔角膜基质细胞用胰酶消化成单细胞悬液，取2×7107细胞于锥形离心管中，根据PKH26操作说明书进行