皮肤成纤维细胞构建角膜基质组织的实验研究

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1、上海交通大学博士学位论文皮肤成纤维细胞构建角膜基质组织的实验研究姓名：张艳青申请学位级别：博士专业：外科学整形外科指导教师：曹谊林20070401口上海交通大学医学院博士学位毕业论文◎皮肤成纤维细胞构建角膜基质组织的实验研究摘要目的组织工程角膜为角膜移植提供了一种可行的供体来源。我们前期的研究表明以角膜基质细胞可以构建角膜基质组织，但角膜基质细胞来源有限，为寻找新的种子细胞来源，我们进行了以皮肤成纤维细胞构建角膜基质组织的探索。方法1以皮肤成纤维细胞构建猪角膜基质组织的初步研究分离培养胎猪皮肤成纤维细胞，收集原代培养4天的胎猪皮肤成纤维细胞，

2、接种聚羟基乙酸(PGA)圆盘支架，形成细胞一PGA复合物，体外培养一周后移植于成年猪角膜基质层内。观察植入组织在角膜内的变化情况，并于第8周取材进行大体和组织学检测。同时，对侧眼采用与实验组相同的方法，设置角膜基质细胞一聚羟基乙酸复合物对照组。2以皮肤成纤维细胞构建兔角膜基质组织分离培养同种异体新生兔皮肤成纤维细胞，用腺病毒转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因标记细胞，接种细胞于聚羟基乙酸(PGA)圆口上海交通大学医学院博士学位毕业论文盘支架，形成细胞一PGA复合物，体外培养一周后移植于成年兔角膜基质层。动态观察构建组织在角膜内的变化情况，

3、并于第3、6、8周取材进行大体和组织学检测，并检测EGFP的表达。透射电镜观察第8周新生组织，并测定组织胶原纤维直径。同时，设置单纯聚羟基乙酸对照组、软骨细胞一聚羟基乙酸对照组和成纤维细胞一聚羟基乙酸体外培养3周对照组。为进一步说明植入的皮肤成纤维细胞在角膜内的转化情况，以免疫组织荧光技术检测实验组和皮肤成纤维细胞一聚羟基乙酸体外培养3周组新生组织中，角膜基质特异蛋白多糖Keratocan的表达情况。结果1以皮肤成纤维构建猪角膜基质组织移植术后8周，角膜逐渐恢复透明，聚羟基乙酸降解吸收完全，新生角膜基质样组织胶原与角膜表面平行，排列较整齐，与

4、对照组无明显差异。2以皮肤成纤维细胞构建兔角膜基质组织术后8周，实验组角膜逐渐恢复透明，聚羟基乙酸降解吸收完全，新生角膜基质样组织胶原与角膜表面平行，排列较整齐。角膜基质组织切片荧光显微镜检测显示GFP阳性细胞的存在。胶原纤维直径检测提示，实验组与正常角膜无统计学差异。单纯聚羟基乙酸对照组，随着材料降解，角膜逐渐透明，但组织学观察见材料移植区无新生组织形成。软骨细胞一聚羟基乙酸对照组，角膜不透明，有明显的软骨组织形成。皮肤口上海交通大学医学院博士学位毕业论文◎成纤维细胞一聚羟基乙酸体外培养3周组，角膜不透明，组织学提示形成与角膜基质完成不同的

5、组织。Keratocan是角膜基质细胞特异分泌的硫酸角质素蛋白多糖，皮肤组织没有表达。实验组新生组织Keratocan表达阳性，而皮肤成纤维细胞一聚羟基乙酸体外培养3周组新生组织Keratocan表达阴性。结论1．以皮肤成纤维细胞可以替代角膜基质细胞构建角膜基质组织，所构建的组织的组织学结构与正常角膜基质组织相似。2．以皮肤成纤维细胞构建角膜基质组织，复合物体外培养时间直接影响构建组织的透明度。3．在角膜微环境的作用下，皮肤成纤维细胞向角膜基质细胞发生了表型的转化。关键词：皮肤成纤维细胞，组织工程，角膜基质，构建口上海交通大学医学院博士学位毕

6、业论文◎RECONSTRUCTIONoFCoRNEALSTRoMAWITHDERMALFIBROBLASTSobjectiveABSTRACTLackofcornealgraftfortransplantationremainstobeamajorchallengeinthetreatmentofcornealblindness．Ourpreviousstudyhasprovedthatnearlytransparentcorneastromacallbeengineeredwithcornealstromalcells．However,th

7、ereisstilltheproblemoflimitedcornealstromalcellsource．Inthisstudy,weinvestigatedwhetherdermalfibroblastscouldreplacecornealstromalcellstoreconstructcornealstroma．MaterialsandMethods1PorcinecornealstromareconstructionDermalfibroblastcellswereisolatedfromfetalporcine，cultured

8、andexpandedinvitro．Fibroblastsatpassage2wereseededontopolyglicolicacid(PGA)non—wov