体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法论文

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1、体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法论文【摘要】目的：研究体外构建组织工程角膜基质的方法。方法：用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理猪角膜基质,在去细胞猪角膜基质材料上接种体外培养的兔角膜基质细胞，并将兔角膜基质细胞进行PKH26荧光标记，在体外构建组织工程角膜基质。用倒置荧光显微镜；HE染色光学显微镜；扫描电镜观察。结果：利用异种去细胞角膜基质组织为支架材料而构建的组织工程角膜基质具有近似正常角膜基质的三维立体结构。结论：以去细胞猪角膜基质材料为支架，利用组织工程技术可成功的在体外构建出含细胞的组织工程角膜基质组织。【关键词】组织工程角膜基质构建Invitroconstructionofc

2、ellulartissueengineeringcornealstromaAbstractAIM:Tostudytheinvitroconstructionprocessofcellulartissueengineeringcorneastroma.METHODS:Porcinecorneastromataacellsarkedbyfluorchromepkh26.Tissueengineeringcorneastromataicroscope,HEstaininglightmicroscopeandscanningelectronmicroscopeahadthesimilarthr

3、eediamensionconstructionalcornealstroma.Conclusion:Acellularporcinecorneastromamaterialscanbeusedascarriermaterialtoconstructtissueengineeringcorneainvitro.·KEYEM培养液并接种于培养瓶中，放置37℃孵箱内培养，每3d换液1次。待细胞汇合后，将原代培养的角膜基质细胞用胰蛋白酶消化后吹打成细胞悬液，种植在盖玻片上，加入DMEM培养液1mL放置于孵箱中孵育24~48h，使细胞长满玻片后丙酮固定15min，将固定好的细胞爬片用0.01m

4、ol/LPBS缓冲液洗3次，每次5min；2.5mL/LTritonX-100处理10min；PBS震洗3次，每次5min；30ml/LH2O2封闭内原性过氧化物酶10min；PBS震洗3次；滴加一抗，Ck（1:150），Vim（1:50），同时设空白对照，PBS代替一抗；37℃，150min；以下操作按免疫组化试剂盒要求进行。滴加DAB室温下显色5~10min，PBS冲洗终止显色反应。逐级脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。将第3代兔角膜基质细胞用胰酶消化成单细胞悬液，取2×107细胞于锥形离心管中，根据PKH26操作说明书进行标记，简单步骤如下：将细胞用PBS清洗后，离心形成松散细胞团

5、块，以试剂盒内稀释液1mL重悬；将1.5μLPKH26染料稀释后加入细胞中快速均匀混合，25℃孵育2~5min（定时颠倒离心管保证充分混匀）；加入等量血清终止反应，孵育1min；含血清完全培养基离心清洗细胞，至少3次；将细胞按所需浓度重悬，接种。1.2方法将PACM在超净台内修剪为直径约12mm圆片放入24孔板内，用DMEM培养液浸泡1~2d，弃去培养液，备用。将标记有PKH26兔角膜基质细胞以4×106/cm2密度接种在备用的PACM上，加入DMEM培养液，放置37℃，50mL/LCO2孵箱内培养，1~2d换液1次。培养5d取材，作HE染色光学显微镜观察；扫描电镜观察；冰冻切片荧光显

6、微镜观察。2结果兔角膜基质细胞消化后1~2h贴壁，细胞伸展呈梭形，胞浆清亮，核居中。3~5d细胞形成密集单层，排列非常整齐，呈漩涡状。细胞免疫组化结果：波形丝蛋白染色阳性（图1），角蛋白染色阴性，证明细胞无上皮细胞的污染，是单一的角膜基质细胞。组织学观察：兔角膜基质细胞伸展呈梭形，在去细胞猪角膜基质材料表面紧密帖附（图2A）。扫描电镜观察：兔角膜基质细胞呈多角形伸展于去细胞猪角膜基质材料的表面，细胞和材料黏附紧密（图2B）。可见去细胞猪角膜基质材料上附着呈红色荧光的兔角膜基质细胞（图2C）图1体外培养兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色阳性3讨论组织工程角膜基质构建成功的关键是应用理想的载体作

7、为细胞外基质来种植角膜基质细胞，形成近似体内的正常结构。这种载体应支持细胞生长，促进细胞融合，具有良好的组织相容性。猪角膜基质与人角膜基质结构相似，有完整的细胞外基质、基底膜、前弹力层和基质，存在多种生长因子，可诱导调节细胞的生长、繁殖、分化、增生。有研究发现角膜基质免疫原性很低，在细胞免疫方面，角膜基质仅占1.62%3。Li等4研究发现角膜基质和角膜缘上皮、角膜成纤维细胞间存在细胞因子调控网络。Friend等5、吴静等6分别在猪角膜基质上培养