车前子多糖对氧化型低密度脂蛋白致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

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1、河北医科大学硕士学位论文车前子多糖对氧化型低密度脂蛋白致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用姓名：车文文申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王素敏20090301中文摘要车前子多糖对氧化型低密度脂蛋白致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用摘要动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是危害人类健康的主要疾病之一。对AS防治药物的研究一直是基础和临床研究的重要课题。高脂血症被认为是AS的高危因子之一，其中氧化型低密度脂蛋I刍(oxidizedLowdensityLipoprotein，OX．LDL)是致AS发生的始动因素，它通过脂质过氧化作用导致内皮细

2、胞受损、分泌多种细胞活性因子和生长因子，促进平滑肌细胞增殖、单核细胞粘附、血小板聚集和泡沫细胞形成，最终导致粥样斑块形成。因此，抑带tJox．LDL的生成或降低ox．LDL对机体的损伤是预防AS发生发展的关键。现今临床主要应用血管紧张素转换酶抑制剂(ACE—I)、D．受体阻滞剂、降脂药、超氧化物歧化酶(SOD)等药物治疗，以试图改善患者受损的内皮功能。但其治疗存在两个主要问题：1、阻断正常生理功能运行所需的物质；2、大部分药物对肝脏、肾脏有毒副作用。西方现代医学认为，AS是属于病因未明的疾病，最好采用缓解和抑制症状为主的医疗策略。中药作为人类维护健康体系的一个重要组

3、成部分，大多数是天然药物，符合“返璞归真"、“回归自然”的潮流，与生物一心理一社会医学模式相适应。中国药典记载，车前子为车前科(Plantaginceae)植物车前的干燥成熟种子。现代药理学研究表明车前子不仅具有清肠通便、降低血脂、调节血糖、免疫调节的功效，还能抑制脂质过氧化物及自由基的产生，并对动中文摘要脉血管壁的重构有重要作用。但是否能改善内皮功能损伤尚不清楚，本实验采用现代技术手段从车前子中提取得到有效成分车前子多糖(plantainseedpolysaccharide,尸．铲)，通过OX．LDL对培养的内皮细胞体外直接损伤，探讨船r尸对损伤血管内皮细胞的保护

4、作用及可能机制，为AS的防治提供进一步的理论依据。一人脐静脉内皮细胞的体外培养及其鉴定目的：建立简单有效且重复性高的人脐静脉内皮细胞(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVECs)体外原代及传代培养技术，并对培养的细胞进行鉴定，为进一步研究内皮细胞功能提供重要的实验方法。方法：(1)配制培养液：分别配制含10％和20％胎牛血清的DMEM培养液，然后加入终浓度为15ng／mlVEGF、100U／ml青、链霉素，用前调节pH值7．O~7．2。(2)HUVECs的原代分离培养：取脐带(大于20cm)，采用I型胶原酶灌注消化法在脐静脉中

5、分离内皮细胞，用含20％胎牛血清的DMEM培养液培养。(3)HUVECs的传代培养：原代分离的HUVECs生长汇合至80％后，胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的DMEM培养液传代培养。(4)HUVECs的鉴定：①倒置显微镜下每日观察细胞形态、贴壁及生长情况；②人第Ⅷ因子相关抗原抗体免疫组化检测。结果：(1)HUVECs生长情况及形态学变化：①生长时间：原代分离的内皮细胞2h左右开始贴壁生长，细胞为扁平多角形，24h完全贴壁，变成梭形，7～10d细胞融合成单层；传代细胞分布较均匀，O．5h左右开始贴壁生长，3-'-'5d长成单层，细胞汇合成典型的铺路石状。②细胞形态：

6、原代培养时，倒中文摘要置显微镜下可见细胞呈小三角形、圆形，多数细胞聚集成团。生长活跃期细胞，呈椭圆形或圆形，边界清楚、胞质丰富，内含小颗粒。传代细胞较原代细胞生长快，细胞密集，分散均匀，倒置显微镜下可见细胞呈短梭形或多角形，胞核变圆，呈铺路石状排列，细胞周围近胞核处可见明显光晕，为典型的内皮细胞生长特点，可以确定所培养的细胞为内皮细胞。(2)第Ⅷ因子相关抗原抗体免疫组化检测：细胞呈圆形、椭圆形或梭形，胞浆丰富，胞质内有棕黄色的染色颗粒，细胞核不着色，呈阳性反应；而对照组(力NPBS液)胞质内无棕黄色的染色颗粒，呈阴性反应，可进一步确认所分离培养的细胞是内皮细胞。结论

7、：血管内皮细胞可从胎儿脐带中利用O．1％I型胶原酶灌注，在37℃水平摇床上消化10min的方法分离获得，并且通过原代和传代培养成为细胞系，倒置显微镜下观察到细胞周围近胞核处可见明显光晕，为典型的内皮细胞生长特点，可以确定为内皮细胞；并利用人第Ⅷ因子抗原抗体免疫组化法检测，进一步鉴定证实培养的细胞是血管内皮细胞。二车前子多糖对氧化型低密度脂蛋白致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用目的：利用OX．LDL对培养的HUVECs造成脂质过氧化损伤，观察PSP对其保护作用和探讨其可能的机制。方法：用MTT方法和化学方法从细胞水平观察OX．LDL对细胞增殖活性及细胞上清液中一氧化