蛇床子素对Aβ诱导的AD细胞模型中NFκB活化机理研究

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1、广州中医药大学硕士学位论文蛇床子素对Aβ诱导的AD细胞模型中NF-κB活化机理研究姓名：郭伟申请学位级别：硕士专业：中医内科学指导教师：王奇20060401中文摘要研究背景：蛇床予素(Osthole，0st)是近年研究较多的中药单体成分之一，现代药理学研究发现Ost具有多方面的药理作用，尤其在促进学习记忆、抗衰老方面应用较多。AD是一种神经系统进行性、退行性疾病，老年斑的核心组分AB与AD的发生明显相关。AB可诱导活化周围的I型星形胶质细胞(AS)过表达B—APP，生成过多的可溶性AD，同时，激活的As分泌的多种细胞因子及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的过表达均对神经元(

2、Neu)具有毒性作用，因而激活的AS在AD的发病过程中起着重要作用，研究As与Neu的交互作用成为探讨神经系统疾病发病机制的热点。NF—KB是一种快反应转录因子，它作为一种多极性基因调控蛋白，是炎症反应、细胞免疫及凋亡等过程的核心调节环节。细胞处于静息状态时，NF—KB-N其抑制蛋白IxB结合成复合物在胞浆与胞核之间穿梭。当细胞受到外界刺激时，起始信号传递反应通过激活抑制蛋白激酶II(1(引起IKB磷酸化。IKB磷酸化是NF-KB信号传导活化最关键也是最普遍的途径，此途径反应十分迅速，5minNP可使NF—KB的活性水平达到峰值。过度活化的NF—KB能导致胶质细胞释放炎症

3、因子、增加载脂蛋白E(ApoE)的表达和氧化应激反应，以致产生细胞凋亡，从而加速AD的发生、发展及其恶化。研究目的：本课题以AS与海马Neu混合培养为靶标，运用CCK一8法检测AB：。所致AD细胞模型的毒性作用，并以AD星形胶质细胞模型为靶标，研究Ost对AB。；诱导的NF_KB活化表达抑制是否与其上调IKBQ的表达有关。方法：建立AS与海马Neu混合培养方法，用倒置显微镜进行形态学观察，结合CCK一8检测细胞活力的方法，选择AB：。造模的浓度和时间；并以Ost预作用于AD星形胶质细胞模型，选择具有较好保护作用的浓度和时间；用激光共聚焦显微镜和LeicaConfocal图

4、像分析软件检测分析FITC／PI双重标记的NF—KB和IKBⅡ在细胞内的激活程度。数据以i±s表示，用SPSSll．0进行统计分析。结果：l混合培养细胞中，As胞体较大，外形扁平，呈星形，胞质较丰富，细胞核圆形或卵圆形，常偏于胞体一侧，细胞突起丰富，符合As形态特点；海马Neu存活率很高、生长迅速，胞体小，胞突丰富而细长，胞核呈圆形或卵圆形，居于胞体中间。2AB以剂量依赖方式对混合培养的细胞呈现一种“营养作用”，40uMAB作用于混合培养细胞24h和48h后具有明显的促增殖作用；检测结果采用两因素方差分析方法，结果发现A口作用时间的变化对细胞的增殖并无明显影响。30st可

5、对抗AB的神经毒性作用，尤其以低浓度(0．01uM-luM)为佳。与模型组相比，其细胞存活率高，细胞损伤相对为小，但随着浓度的升高，对细胞的保护作用呈减弱趋势。0st作用时间的变化对细胞的增殖作用虽无明显影响，但0st预作用于细胞24h时对细胞的保护作用较好。440uM的A0作用于AS24h可过度活化NF-KB的表达。低浓度的0st对正常AS中NF—KB的活化无明显作用，但在AB病理损伤中，可明显抑制NF—KB的过度活化。5IKBd在正常AS内可能处于高表达状态，而40uM的AB作用于AS30min即可明显激活IKBa发生磷酸化及降解。低浓度0st对正常AS内的IKB磷酸

6、化无明显作用，但在Ae病理损伤中，却能上调细胞核内IKBq的表达。结论：单层融合状的AS是海马Neu生长的最佳底物。水溶性的AB：。。对单纯培养的NGl08-15细胞株、海马神经元和AS均具有神经毒性作用，但对混合培养的细胞未造成神经毒性损害。低浓度的0st对AS有保护作用。40uMAB可诱导AS中的IKBd过度磷酸化，进而使NF-KB过度活化表达。低浓度的0st对正常AS中的IKBn和NF-KB的表达无明显影响，但在A0病理损伤中，却可上调AS内IKB11的表达，抑制NF—KB的过度活化。这可能是0st抑制AB的神经毒性作用、延缓AD发生发展的作用机制所在。关键词蛇床子

7、素；NF-KB；IKBQ；阿尔茨海默病；星形胶质细胞TheMechanjSKIofOsthole；nAdjustedActjvati013ofNF—KBnducedbyAB25-35inADCeIIModeAbstractSpeciaIity：internaImediCineofTCMAuthor：GuoWeiTutor：ProfessorWangOiOBJECTIVE：Toexplorethecellsurvivalofmixedastrocytic／neuronalculturestreatedwiththesoluble