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1、蛇床子素对AB2535诱导的星形胶质细胞NFkB活化机制的影响作者：程淑意，陈云波，王奇，梁伟雄,温泽淮【摘要】【目的】探讨蛇床子素(Osthole,Ost)拮抗B淀粉样蛋白2535(A32535)毒性损伤、保护神经细胞的作用及其与核因子kB(NF讣)活化机制的关系。【方法】以原代培养的大鼠星形胶质细胞(astrocytes,AS)为靶标建立阿尔茨海默病(Alzheimersdisease,AD)细胞模型。采用CCK8(cellcountingkit8)法检测细胞活力，进行A32535造模浓度、时间以及Ost预处理最适宜浓度的选择。经AB2535和Ost干预后，采用激光共聚焦显微
2、镜检测分析异硫氤酸荧光素/碘化丙(FITC/PI)双重标记的NFkB与其抑制蛋白(IkBa)在细胞内的激活程度,结合形态学观察分析Ost对星形胶质细胞的保护作用。【结果】Ost可拮抗A02535的神经毒性作用，尤其以低浓度(001〜111mol/L)为佳，随着浓度的升高，对细胞的保护作用呈减弱趋势。40umol/L的AB2535作用于AS24h可过度活化NFkB的表达(P【关键词】蛇床子素/药理学；阿尔茨海默病/中药疗法;星形胶质细胞/病理学；细胞培蛇床子是伞形科一年生草本植物蛇床［Cnidiummonnieri(L)Cusson］的成熟果实，蛇床子素(osthole,Ost）是
3、从蛇床子中提取的一种天然香豆素。研究表明[15],Ost对机体多个系统均具有较好的作用，尤其在中枢神经系统方面，如改善学习记忆、抗衰老、镇静抗炎等。Ost防治疾病的作用机制以及核因子kB（nuclearfactorkappaB,NFkB）作为一种重要的核转录因子在此机制中所起的作用尚属未知。本研究通过观察Ost保护星形胶质细胞（astrocytes,AS）的作用及其与NFkB信号传导通路之间的联系，初步探讨Ost在细胞学领域防治阿尔茨海默病（Alzheimersdisease,AD）的作用机制。现将结果报道如下。1材料与方法11实验动物新生24h内的SPF级SD大鼠由广州中医药大
4、学实验动物中心提供[合格证号：SCXK（粤）XX0001]o12主要试剂和仪器蛇床子素（购自中国药品生物制品检定所，批号：110822XXO5）,0淀粉样蛋白2535（AB2535）冻干粉（购自首都医科大学宣武医院神经生化室）,CCK8（cellcountingKit8）试剂盒（购自株式会社同仁化学研究所），高级DMEM（高糖）培养基（Gibco公司）,特级胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶粉末（Amresco公司），NFkBp65兔抗鼠抗体（Calbiochem公司），NFkB抑制蛋白（IKBa）兔抗鼠抗体仲山金桥公司），羊抗兔异硫氧酸荧光素（FITC）IgG（Invit
5、rogen公司），碘化丙噪（PI）和RNA酶A（Sigma公司）。AEG120型电子天平（日本岛津）,WTB150型C02培养箱（德国Binder）,多功能自动酶标仪（瑞士Tecan）,德国Leica的倒置显微镜、激光共聚焦显微镜以及图像分析软件。13星形胶质细胞的培养和AD细胞模型的建立［6］本实验室前期研究采用新生24h内的SPF级SD大鼠已成功建立了纯化的原代星形胶质细胞（AS）体外培养技术，经鉴定其细胞纯度达到95%以上。同时采用四甲基偶氮呼盐（MTT）法检测细胞毒性，实验结果显示,40umol/L的AB2535作用于纯化培养的AS,能较好地模拟AD细胞病理损伤。14蛇床
6、子素对AD细胞模型活力的影响141AD细胞模型的建立将纯化培养的AS接种到96孔板上，培养至细胞长满孔底80%左右，吸弃旧的培养液,以终浓度为40umol/L的AB2535作用于星形胶质细胞24h后,倒置显微镜下观察细胞的生长状态和形态变化。XX年第27卷广州中医药大学学报程淑意，等•蛇床子素对A32535诱导的星形胶质细胞NFkB活化机制的影响［1/2］第1期142蛇床子素对AD细胞模型活力的影响将纯化培养的星形胶质细胞按25X104〜3X104/孔的密度接种到96孔板中，并随机分为7组：正常组，模型组，001Umol/LOst组，01limol/LOst组，1umo1/LOs
7、t组，10umol/LOst组，100Pmol/LOst组，6孑L/组。24h后倒置显微镜下见细胞长出突触并呈相互融合状态后，给Ost各浓度组加药，分别于加药后12、24、48h时，除正常组外，其他各组均加入终浓度为40Pmol/L的AB2535继续培养24ho在所有实验孔中加入CCK8液10uL,置培养箱中继续培养lh,可见橙黄色结晶物(即甲月賛)形成，采用酶标仪测各孔吸光度(D)值，检测波长为450nm。15NFkB和IkBa活性的检测151实验分组将纯化培养的星形胶质细胞按
