槲皮素对反应性星形胶质细胞作用的分子机制

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文槲皮素对反应性星形胶质细胞作用的分子机制Molecularmechanismofeffectofquercetinonreactiveastrocytes课题来源：国家自然科学基金项目专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员临床检验诊断学姚芳吴炳义教授吴晓蔓教授李林教授温旺荣教授郑卫东主任技师曾方银主任技师论文评阅人贾卫华教授王雪敏教授2012年5月10日广州f幽㈣㈣㈣删舢Y2525272硕士学位论文槲皮素对反应性星形胶质细胞作用的分子机制硕士研究生：姚芳指导教师：吴炳义教授摘要研究背景和目的星

2、形胶质细胞是中枢神经系统含量最丰富的细胞，分为原浆型和纤维型两类，前者主要分布于灰质，后者分布于整个大脑白质，但两种形态的星形胶质细胞都具有很多重要的生理功能，如维持内环境的稳定、清除兴奋性物质、支持营养神经元的再生和功能、促进突触的形成和重塑。当中枢神经系统受至UO'J伤、缺血缺氧、感染和神经变性等病理性损伤时，星形胶质细胞发生胞体肥大、突起变细变长、基因的表达发生改变等应激性的活化；而当受到持续严重损伤时，活化的星形胶质细胞发生反应性增生和增殖，迁移至损伤部位与周围的免疫细胞、少突胶质细胞、成纤维细胞以及各种细胞外基质形成胶质瘢痕。可见，

3、中枢神经系统损伤是由大量细胞内和细胞外信号分子调控的多细胞反应过程，而反应性星形胶质细胞在这个复杂的生物过程中既可以发挥有益的作用也可以发挥不利的作用。在众多的脑损伤模型中，反应性星形胶质细胞和形成的胶质瘢痕在脑缺血缺氧损伤中的作用和机制以及寻求有效的方法来预防或者治疗相关的脑疾病一直是研究的热点和难点。槲皮素是一种黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜、水果和植物中。大量研究报道槲皮素具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤和神经保护等作用。很多研究已经表明槲皮素可以通过改变反应性星形胶质细胞基因的表达来保护神经元和减少神经变性疾病的发生发展。因此，探讨槲皮素对反

4、应性星形胶质细胞基因表达的摘要影响及其作用机制，将为我们后续研究槲皮素和反应性星形胶质细胞在脑损伤中的作用奠定了基础，也为胶质疤痕的形成机理提供新的研究思路。本研究分为以下三个部分：第一部分槲皮素对缺血缺氧损伤星形胶质细胞基因表达的影响我们应用高密度基因表达谱芯片技术筛查槲皮素处理后缺血缺氧损伤的星形胶质细胞表达差异的基因，并用实时荧光定量PCR进行了逐一验证，以明确哪些基因参与槲皮素对反应性星形胶质细胞的作用，为后续探讨槲皮素作用的分子机制提供研究理论基础。第二部分槲皮素对AIF．1和Rac2在反应性星形胶质细胞中表达的调控作用根据第一部分

5、研究的结果，我们从差异表达的基因中，选择AIF．1和Rac2两个基因，利用我们建立的体外炎症及损伤模型，进一步研究槲皮素对星形胶质细胞AIF．1和Rac2表达的影响，以明确AIF．1和Rac2在炎症、损伤后的作用，以及槲皮素在抑制反应性胶质细胞增生中的作用。第三部分槲皮素对胶质瘤U87细胞生长和迁移的影响我们以往的研究发现，槲皮素抑制反应性星形胶质细胞的增生和迁移，而胶质瘤是一种来源于星形胶质细胞系的常见的恶性肿瘤，最主要的特征就是高度的增殖性和侵袭性。胶质瘤对放化疗不敏感，且对多种药物具有抵抗性。本文初步地研究槲皮素对胶质瘤细胞生长和迁移的

6、影响，旨在为探索胶质瘤发生发展的分子机理奠定基础，为寻找有效的治疗措施提供可能。第一部分槲皮素对缺血缺氧损伤星形胶质细胞基因表达的影响一、实验方法1．利用机械分离法培养原代星形胶质细胞，并用免疫细胞荧光染色鉴定细胞的纯度。硕士学位论文2．构建体外缺血缺氧模型，将体外原代培养的星形胶质细胞分为正常组(C组)、正常+槲皮素处理组(C+Q50组)、缺血缺氧组(H组)和缺血缺氧+槲皮素处理组(简称槲皮素处理组，或H+Q50组)。操作步骤：将C组和C+Q50组培养皿中的培养液移去，分别加入2ml的10％FBS低糖DMEM培养液置于37。C5％C02培养

7、箱中培养4h，而H组和H+Q50组细胞培养皿中的培养液移去后分别加入2ml的DMEM无糖培养液置于厌氧培养箱(填充含5％C02+95％N2混合气体)培养4h；4h后四组细胞同时取出，C组和H组培养皿中的培养液移去后更换培养液为10％FBS低糖DMEM培养液，而C+Q50组和H+Q50组更换含50¨mol／L槲皮素的10％FBS低糖DMEM培养液，换液后四组同时放于37。C5％C02培养箱中培养24h。3．按上述方法处理原代星形胶质细胞后，我们用LIVE／DEAD染色和LDH释放率来检测细胞的存活率和槲皮素对细胞的毒性作用。4．应用基因表达谱芯

8、片筛选缺血缺氧组和缺血缺氧+槲皮素处理组的细胞表达差异的基因并用实时荧光定量PCR方法进行验证。二、实验结果1．原代的星形胶质细胞胞体经GFAP染色后鉴定，阳性细胞