槲皮素抑制胶质疤痕愈合的分子生物学机制的探究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文槲皮素抑制胶质疤痕愈合的分子生物学机制的探究Explorethemolecularbiologicalmechanismofquercetininhibitingglialscarhealing课题来源：国家自然科学基金项目学位申请人苑召虎导师姓名吴炳义专业名称临床检验诊断学培养类型学术型培养层次硕士所在学院第一临床医学院2013年5月10日广州硕士学位论文槲皮素抑制胶质疤痕愈合的分子生物学机制的探究硕士研究生：苑召虎指导教师：吴炳义摘要研究背景和目的槲皮素是一种广泛存在于自然界(如蔬菜、水果及其他日常饮食)中

2、的具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤和神经保护作用的黄酮类化合物。大量研究表明槲皮素可通过改变反应性星形胶质细胞基因的表达来保护神经元和减少神经变性疾病的发生发展。因此，探究槲皮素对划痕愈合的影响及其作用机制，将为我们后续研究槲皮素和反应性星形胶质细胞在脑损伤中的作用奠定基础，也为胶质疤痕的形成机理提供新的研究思路。胶质成熟因子，是由142个氨基酸残基组成的分子量为17kDa的蛋白质小分子，主要包括胶质成熟因子-I](GMFB)和胶质成熟因子一r(aMFG)。GMFB主要表达分布于脊椎动物的大脑中，在神经元和胶质细胞的生长和分化中起了重要的调节作用。G

3、MFG，胶质成熟因子家族的一个新成员，其基因序列和氨基酸序列和GMFB具有高度的相似性(在大鼠中，其基因水平的相似度达71％；氨基酸序列的相似度达78．9％)，故将其命名为胶质成熟因子吖。GMFG的表达分布与GMFB的表达分布不同，GMFG高度表达分布在造血系统(包括粒细胞性白血病和淋巴细胞性白血病)、胸腺、脾脏、胚胎的肝脏及肺脏中，GMFG的进化与有分化和增殖潜能的造血免疫系统的进化同步。GMFG在神经和大脑中的表达分布并不比其他组织中高，大鼠大脑中GMFG的mRNA可在大脑海马CA3区的锥体细胞中检NN[5]。GMFG在大鼠(鼠龄为E14．

4、P1)的视网膜的内限膜中也可被探测到，对其胶质细胞的生长和分化可能起了重要作用。但是到目前为止，摘要GMFG在大脑中详细的表达分布状况及其功能仍然未知。近年来更多的研究聚焦于槲皮素的抗肿瘤作用，研究表明槲皮素可诱导多种肿瘤细胞的凋亡如白血病细胞、胰腺癌细胞等。口腔鳞状上皮癌，是世界上第六种最常见的恶性肿瘤；外科手术和放疗／化疗是治疗口腔鳞状上皮癌的最佳选择方案，但口腔上皮癌细胞的多重耐药性是其化疗根治和化疗失败的一大难题。P-glycoprotein(P-gp)是介导肿瘤细胞多重耐药的主要机制之一，大量研究显示槲皮素能抑制P-gp的表达，降低多

5、种肿瘤细胞的耐药性，如人胰腺癌细胞和Caco一2细胞；而是否槲皮素可以抑制口腔鳞状上皮癌的生长，并通过降低P-gp的表达来逆转其多重耐药性目前尚不清楚。本研究分为以下三个部分：第一部分槲皮素抑制胶质疤痕愈合的分子生物学机制的探究一、实验目的建立体外星形胶质细胞的迁移模型，探究槲皮素对划痕愈合及其对胶质疤痕中星形胶质细胞增殖和迁移的影响，并探究其可能的分子生物学机制，为胶质疤痕的治疗寻找一种潜在的药物。二、实验方法1．星形胶质细胞GFAP染色鉴定原代星形胶质细胞经GFAP免疫荧光染色后进行纯度鉴定，阳性细胞达95％以上，符合实验要求。2．体外星形

6、胶质细胞迁移模型的建立及应用实验分为三组，第一组为对照组(C组)，仅作划痕处理；第二组为划痕加DMSO处理组(D组)，第三组为划痕加槲皮素处理组(Q组)；划痕操作如下，于35mm培养皿的盖上划出纵横交错的九道格，将盖置于胶质细胞培养皿下面，用10}tL加样器枪头沿盖上的格横竖各划九道，换液除去脱落细胞，然后置于5％的C02培养箱中进行培养，每组三个培养皿。在低倍镜下拍照，并通过NISElementsD软件测量划痕的宽度，以此作为该视野划痕的宽度计算其迁移指数。迁移指数的计算公式为：硕士学位论文Ix_3Lx／(Lc+LD+LQ)。3．Wester

7、nblot通过Westernblot分析槲皮素对casp嬲e-3、ERKl／2及p-ERKl／2蛋白表达的影响；然后通过Gel-Proanalyzer(AlphaInnotechCorp，CA)分析软件，对蛋白的表达状况进行定量分析(目的蛋白／内参蛋白)。4．Live／Dead染色培养成熟的星形胶质细胞用PBS洗三遍以后，取2001．tLLive／Dead混合标记液加入到各组培养皿中进行避光染色15min后，于激光共聚焦显微镜下观察活细胞(呈绿色)和损伤细胞(呈红色)的情况。5．Click-iTEdUTest培养成熟的星形胶质细胞半量换液，加入

8、lmL含20pmol／LEdU的全培养液。将其置于37℃，5％的C02的培养箱中培养24h后弃去培养液，加入lmL3．7％甲醛室温下固定15min，用