cDNA测序和表达谱研究

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1、cDNA测序和表达谱研究一、cDNA测序cDNA：与信使RNA互补的DNA，代表了基因的生物学信息。基因：约占总序列的3％-5％1991年，Venter等：提出大规模cDNA测序研究战略建立了表达序列标签(expressedsequencetag，EST)技术。EST：长度为300～500bp的部分cDNA对人类基因转录图的制作、全长基因的克隆、基因表达谱的研究等有重要作用。公共数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov／dbEST)UniGene：为了弄清EST间的关系，美国国立生物技术信息中心(NCBl)根据EST相似性比较进行聚类分析，形成数据库UniG

2、ene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov／UniGene)当前cDNA测序的趋势:由对EST的随机测序，转向全长cDNA的克隆和测序。全长cDNA是功能基因组学和比较基因组学研究的基础，有功能意义的全长cDNA可以申请专利，因此，除研究部门外，大药厂和生物技术公司也投入重金进行研究和抢占专利。目前大部分的全长基因有待于克隆。随着人类基因组DNA测序的快速进展，众多EST可供利用，生物信息学手段的增多和cDNA文库构建技术的完善，使得能够获得转录物较长的全长cDNA和低转录基因。目前，美国NIH启动了全长cDNA计划—哺乳动物基因采集计划(MammalianGeneColl

3、ectionProject)，加之其他国家的加入，大大加快了全长cDNA的识别和克隆工作。中国的人类基因组计划起步较晚，但坚持“有所为，有所不为”的原则，充分利用自己的资源优势和研究基础，提出对特殊组织如造血细胞、神经内分泌细胞、树突状细胞、胚胎器官等,或疾病如白血病、肝癌等进行大规模EST测序,进行基因表达谱分析，同时完成1％人类全长cDNA的识别和克隆任务。(一)大规模EST测序流程并非简单个别cDNA测序的累加，是现代生物技术和现代管理方法的结合，是生物学与计算机科学的结合。大规模EST测序：多采用流水线作业及计算机辅助管理系统。主要步骤：1)cDNA文库构建2)DNA测序3)信息处理和

4、管理4)生物信息学分析1.cDNA文库构建研究目的不同—采用不同的cDNA文库构建方法。①表达谱分析：常规的cDNA文库，如：oligo-dT引物定向克隆cDNA文库或随机引物法构建cDNA文库；②获得更多的全长cDNA：构建全长cDNA文库，如：smart-PCR和oligo-PCR；③增加EST种类：均一化(normalized)cDNA文库；④克隆不同状态(药物处理的不同时相、不同病理及疾病的不同发展阶段等)的相关基因：减式cDNA文库构建方法。(1)oligo-dT引物定向克隆cDNA文库最常用、大多数cDNA文库构建的方法；多数EST来自该文库。主要步骤：RNA和mRNA抽提，以mR

5、NA为模板用oligo-dT作反转录引物合成cDNA第一链，在DNA聚合酶I作用下合成第二链，加上接头后定向装入λ噬菌体。(2)CapFinder-PCR/oligo-PCR文库主要特点：利用mRNA5’帽状结构设计引物，该引物含有oligo(G)以对应于帽状结构的脱氧胞嘧啶，反转录反应时易于合成含有全长的第一链cDNA，用5’和3’引物(oligo-dT)进行PCR扩增获得双链DNA，装入λ噬菌体。该种文库含有较高比例的全长cDNA，也适于样本量较少的组织构建cDNA文库。(3)均一化cDNA文库特点：将低丰度表达基因识别和克隆出来各个实验室所采取的具体方法不同，效果也不一致。主要目的：减少

6、测序量，尽可能识别更多的基因尤其是低转录基因。构建文库时：通过控制PCR反应减少高丰度基因扩增，或采用自身mRNA乳胶吸附方法减少高丰度mRNA；构建cDNA后，也可以通过杂交的方法去除部分高表达的基因，或者通过循环杂交、吸附的方法去除已经测序基因。(4)减式cDNA文库根据研究目的，可采用不同的减式方法。如要获得药物处理后上调的基因，采用前向(forward)减式方法，即用药物处理前mRNA杂交或吸附药物处理后的mRNA；反之，要获得药物处理后下调的基因，则采用后向(backward)减式方法。缺点：该方法尚不完善和不稳定，所获得的结果需Northern印迹法证实，并且插入子的片段较短，缺少

7、5’或3’端，对低丰度mRNA效果不佳。目前，多主张将减式方法和均一化方法合起来，对相关的低丰度表达基因可能效果更好。2．EST测序cDNA测序：也采用双脱氧核糖核酸法。过程主要包括：模板制备、测序反应、电泳和识别(在测序仪上进行)。测序模板制备可采用质粒抽提法或PCR扩增产物。①质粒抽提法：技术较为完善，步骤：挑取菌落、细菌(质粒)增殖、质粒DNA抽提及鉴定等环节。②PCR扩增产物测序：已为多数