拟黑多刺蚁pah基因和tph基因cdna测序mrna表达及发育相关性研究

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1、拟黑多刺蚁PAH基因和TPH基因cDNA测序mRNA表达及发育相关性研究第1章前言1.1芳香族氨基酸经化酶的综述芳香族氨基酸径化酶家族（Aromaticaminoacidhydroxylase,AAAH)包括三种酶，即色氨酸径化酶（tryptophanhydroxylase,TPH)、酪氨酸经化酶（Tyrosinehydroxylase,TH)和苯丙氨酸轻化酶（Phenylalaninehydroxylase,PAH)。该家族属于一类非血红素铁离子的单加氧酶，以四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4)为辅酶，利用分子氧提供的氧原

2、子来氧化相应的芳香族氨基酸底物[1，2图1-1)。其中，L-苯丙氨酸在苯丙氨酸轻化酶作用下生成酪氨酸，此反应为不可逆反应，是苯丙氨酸代谢过程中唯一的限速途径，因此将苯丙氨酸轻化酶归为生物体分解代谢酶类[3]。色氨酸轻化酶是生成5-经色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT)途径的关键酶和限速酶。它催化L-色氨酸生成5-轻色氨酸（5-hydroxytryptophan,5-HTP)。酪氨酸经化酶以L-酪氨酸为催化底物，生成多巴（dopa)，接着经过多巴脱梭酶催化作用下生成多巴胺（dopamine，DA)。因此酪氨酸经化酶被认为是催化儿茶

3、酷胺类递质的起始酶和限速酶[5]。在大脑中，约80%的儿茶酷类神经递质是多巴胺。相对于分解代谢酶类苯丙氨酸经化酶而言，色氧酸经化酶和酪氨酸轻化酶属于合成代谢酶类。哺乳动物中芳香族氨基酸经化酶在结构上具有高度相似性。该家族蛋白由四个亚基组成，每个亚基包括三个结构域，即C端低聚反应结构域、催化中心和N端调节结构域（图1-2)。其中，C端调节结构域包括40至50个氨基酸残基，为疏水性末端；催化中心大约由280个氨基酸残基组成，构成了芳香族氨基酸轻化酶的保守结构域。N端调节结构域通常为亲水性末端，包括一个磷酸化位点，但因其序列相似性很低，组成的氨基酸残基数目

4、也不同，推测与该酶的催化活性、底物特异性以及调控机制有关[7]。1.2苯丙氨酸轻化酶的研究苯丙氨酸经化酶广泛分布于植物、动物和微生物中，是生物体代谢的关键酶。在人体内，L-苯丙氨酸属于必需氨基酸，除一少部分用于合成蛋白质，其余在肝脏中经苯两氨酸经化酶催化生成L-酪氨酸（L-tyrosine，TYP)，该反应需要BH4、02和Fe2+参与。反应产物L-酪氨酸一部分进入糖异生途径分解，其余在脑部经酷氨酸经化酶作用生成L-多巴（L-dopa)，L-多巴在多巴脱接酶（dopadecarboxylase,DDC)的脱梭作用下生成多巴胺，最后经一系列反应生成肾上

5、腺素和黑色素等儿茶酌胺类神经递质(图1-3)。当人体内苯丙氨酸轻化酶合成受阻，导致苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸，引发血液、脑脊液、各种组织液和尿液中苯丙氨酸的浓度急剧升高，造成苯丙氨酸代谢紊乱，最终引起苯丙酮尿症。苯丙酮尿症患者的症状表现为：发肤色浅，尿液和汗液中散发出鼠臭味[9]，智力低下，精神情绪异常，伴有癫痫症状。若不及时治疗，会对患者脑和神经系统造成不同程度的损害。1983年，P反应元件。其结果反映了人类苯两氨酸经化酶基因启动子中缺乏TATA框，并被多种转录因子调控。SeymourKaufman等人经研究发现苯丙氨酸轻化酶刺激物是苯丙氨酸经化

6、酶代谢系统中的重要组成部分，它与肝脏因子1的二聚化辅助因子有关，该辅助因子在肝脏因子1存在时，能够促进人类苯丙氨酸经化酶基因表达。在人类苯丙氨酸轻酶代谢系统中，苯丙氨酸经化酶刺激物具有辅助四氧生物噪呤因子再生和增强苯丙氨酸轻化酶表达双重功能。ChristensenR等[16]人研究显示人类苯丙氨酸经化酶基因具有多个转录启动位点，临近启动子上游-121bp片段具有人们未知但又普遍存在的蛋白质结合位点，这些序列的突变均能够降低启动子活性。第2章研究内容和技术路线2.1研究内容(1)拟黑多刺蚁iM/f及TP//基因的克隆运用RT-PCR技术克隆和PvTP/

7、/的保守区域,再用RACE技术克隆5'-非编码区和3'-非编码区，从而得到Pv/M//和PvTP//全长cDNA序列，利用ORFFinder寻找开放阅读框，并将其上传至GenBank获得序列号。(2)拟黑多刺蚁PAH及TPH生物信息学分析及其蛋白结构预测利用生物信息学对PvPAH和PvTPH蛋白质序列进行分析，其分析内容包括蛋白质的基本性质、同源性分析、保守结构域、功能基序、二级结构、三级结构以及系统进化等。(3)拟黑多刺蚁mRNA及rP//mRNA定量表达及其与发育相关性分析对拟黑多刺蚁不同品级和不同发育阶段的总RNA进行提取，在同

8、源性高的区域设计特异性引物，运用RQ-PCR技术,通过Q值和标准曲线对目的基因的mRNA水平进行定量分析，从