质谱测序 第三代测序

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1、第三代测序技术与质谱测序技术的介绍和比较质谱蛋白测序质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。一级质谱主要是给出目标物的分子量，GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。二级质谱可以看出目标物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptidemassfingerprint，PMF)可以初步推测蛋白质的种类、序列。PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹图谱。由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶

2、解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列。得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不

3、同的碎裂离子：即N端的a,b,c型离子与C端的x,y,z型离子.每种断裂类型分别生成互补的两种离子,如a-x,b-y,c-z。最常见的是a型离子、b型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。第三代测序测序技术在近几年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies纳米孔单分子测序

4、技术，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。SMRT（singlemoleculeReal-Time）测序技术该技术其实应用了二代测序边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记的4种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。具体的反应在零级波导孔(zero-modewaveguides,ZMW)的纳米结构中完成。这种ZMW是直径50-100纳米，深度100nm的孔状纳米光电结构，通过微加工在二氧化硅基质的

5、金属铝薄层上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，从而使得孔内仅有靠近基质的部分被照亮。Φ29DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再加入四色荧光标记的dNTP(A555-dATP,A568-dTTP,A647-dGTP,A660-dCTP)。当DNA合成进行时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长(约200ms)，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。SMRT的测序原理如图所示。图A显示的是ZMW

6、的结构，激光进入ZMW后呈指数级衰减，仅能照亮靠近底部的约30nm区域，因此大部分游离的荧光标记dNTP不会被激发，只有结合到DNA聚合酶上的dNTP其荧光基团被激光照亮，激发荧光。图B显示的是DNA合成过程中检测到的荧光信号及持续时间。结合到酶上的dNTP停留时间较长，信号呈脉冲式激发，因而能够与噪音区分。另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高，达到15%。但好在

7、它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔，当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。纳米孔测序的主要特点