稻瘟病菌基因表达的表达序列标签和cDNA阵列检测研究

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1、洳；●—工‘●▲一一q)Y905135密级：_掌⑧·蹲士学位论文稻瘟病菌基因表达的表达序列标签和cDNA阵列检测研究研究生：金迭超指导教师：奎焦蓝塾攮专业：植物瘟堡生一所在学院：壅些墨生塑堇苤堂陵中国杭州稻瘟病菌基因表达的表达序列标签和cDNA阵列检测研究摘要：稻瘟病菌[^如矽印or抽P∥蠡gn]引起重要水稻病害。稻瘟病互作系统作为真菌一植物互作分析的模式系统被广泛地研究。目前，研究重点主要集中在稻瘟病菌致病相关发育特别是附着胞的诱导、形成和成熟及其信号传递途径对基因的表达和调控等方面。本文构建了稻瘟病菌的表达序列标签(Esn数据库，并且利

2、用本实验室保存的稻瘟病菌独立克隆制备的cDNA阵列进行了病菌不同发育时期和依赖脚缓朋々MAPK信号转导途径相关基因缺失突变体中基因表达谱的检测。1．本文构建了稻瘟病菌菌株Y34菌丝、孢子、疏水表面诱导2h、8h、20h和30h的芽管、幼附着胞、不同成熟附着胞等六个发育时期的cⅨqA混合文库。从这个文库中获得13057条3’EsTs，拼接出4756个假定独立转录本(n月s)，包含961个contigs和3795个sinmetons。在全部拼接出的TuTs中，根据BLAsTx搜索结果，2339个TuTs为稻瘟病菌未知基因(E>10“5)，剩余的

3、2417个TuTs为功能注释基因，其中36个注释TuTs描述为稻瘟病菌功能蛋白。BLAsTn结果显示，菌株Y34有763个TuTs与菌株70一15基因组序列不能匹配(E>10。)，表明稻瘟病菌不同菌株基因间存在较大差异。2．利用上述稻瘟病菌EsT数据库制各了含4108个独立克隆的稻瘟病菌cDNA阵列，用这些cDNA阵列检测病菌上述六个发育时期的基因表达谱，Cvbcr．T程序共鉴定出511个差异表达基因(，2)。定量PCR分析检测了4个差异表达基因和1个无差异表达基因在这6个发育时期的表达丰度，验证了cDNA阵列数据的可

4、靠性。国NA阵列分析表明，以菌丝或孢子为参比，在稻瘟病菌孢子萌发后的发育过程中，大量基因上调表达，其中主要集中在附着胞成熟时期。仅在菌丝和孢子中差异表达的基因分别有46个和lO个，在附着胞的诱导、形成和成熟等发育时期中，剩余差异表达基因主要呈现7种表达谱类型。在病菌不同发育时期，分别鉴定出许多重要的差异表达基因(M8铲aportllec君P?，cyPJ，删G磅P豫露?，膨PGJ和yeast期弦，protemyrosinephosphataSegcneetc．)的同源基因。3．用含4108个稻瘟病菌独立克隆的cDNA阵列检测四个稻瘟病菌爿皤，

5、MAPK途径相关基因脚巧D、埘刀J、脚r7和捌皤，分别缺失的突变体及其野生型菌丝的基因表达谱。以野生型为参比，在突变体Ⅲ聒0、MⅡJ、m盯7和pm船中分别鉴定出86个、60个、151个和264个显著差异表达的基因(P2)。定量PcR验证了cDNAII阵列数据的可靠性。在四个突变体中仅发现3个基因都显著差异表达，包括共同上调表达的葡萄糖抑制基因(G慵，)。调节基因J=l拈巧碓≈失主要导致基因上调表达，包括跨膜蛋白、RaS相关蛋白等信号传递相关基因，表明该基因还参与其它信号传递过程。级联通路组分基因^舔几J、^据r7和P^

6、Ⅸ，分别缺失导致30个基因都显著差异表达，其中28个是下调基因，表明MAPK途径的^舔"，扎舔，7一P^缓J级联通路在菌丝发育过程中确实存在，并以正调控基因的表达为主。这三个组分基因缺失还分别导致不同基因的差异表达，尤其在突变体芦m纠中，发现一些调控胁迫反应的信号传递过程有关的转录因子(锌指蛋白和胁迫反应元件结合蛋白等)上调表达。因此，在翩硝JMAJPK途径各组分位点上还存在不同信号转导支路途径，调控不同的代谢和生物学过程，在组分脓』位点，病菌胞内的不同信号途径间可通过尸脱KZ相互作用。基因表达的聚类分析和定量PCR检测表明，稻瘟病菌菌丝发

7、育过程中，依赖P艇，的MAPK信号转导途径的相关基因至少存在两种表达模式，主要通过^嬲巧D和捌幽(』位点，存在P^掰，MAPK和与其它信号途径问的相互作用。关键词：稻瘟病菌，表达序列标签，cDNA阵列，检测，发育，MAPK信号转导途径，突变体HIStudyonGeneExpressionin^Z醒印(pDrj协Pg—sP口byExpressedSequenceTagsandcDNAAHayMonitomgAbstract：The缸1911s脚印D，所8g胁e以causesa11importantriceblast．Thericeblastp

8、amosysteIIlasamodelsystemfbr劬gus-hostintemctionhasbeeninvestigatedintensively．Nowst【ldies