结球白菜结球期叶片的表达序列标签及基因表达分析研究

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1、首都师范大学博士学位论文结球白菜结球期叶片的表达序列标签及基因表达分析姓名：戴大鹏申请学位级别：博士专业：植物学指导教师：曹鸣庆;马荣才20040601摘要结球自菜(Brassica，·apaL．ssp．pekinensh；)原产于我国，是我国北方地区的重要蔬菜之一。在长期的自然进化和人工选择的共同作用下，形成了以贮藏营养物质为功能器官的11‘}．球。研究叶球的形成过程无疑对于提高大白菜的产量和品质有着重要的意义。目前有关结球机理的研究在国际范围内仍然处于起步阶段。为了从基因组水平了解结球期叶片的基因表达情

2、况，实验室先前构建了结球白菜结球前期包心叶和球叶eDNA文库，通过对文库的进一步处理和分析，我们获得了以下主要结果：利用kZipLox噬菌体侵染寄主菌DHIOB，完成了eDNA文库中2967个阳性噬菌体克隆向质粒克隆的转变，并完成全部转化菌的质粒提取工作。随机挑选质粒进行序列测定，获得2802个较好的测序结果，其中1361个序列为自测，1441个序列由上海生工及鼎国生物技术公司测定。对影响测序反应的因素进行了探索，发现所用质粒模板的纯度和用量是影响测序成功与否的关键因素。初步分析表明，插入片段长度小于150

3、bp或者全为polyA的序列共268个，没有任何插入片段的空载体序列有162个。去除以上两类序列后，共获得2372条可用于后续分析的有效EST序列，占全部序列的84．6％。全部片段总长度为1088467bp，平均每EST长度为459bp，高于同类物种EST研究报道的平均长度。利用DNAStar软件中的SeqmanlI模块对2372条EST序列进行片段重叠群(eontig)分析，共计获得1641个不同的片段重叠群，所有eonfig全长为782616bp，平均长度为477bp。其中，1247个contig仅由一

4、条EST组成(52．6％)，即singletons。结合blast比对结果，估算非冗余序列数目应在1499个左右，冗余序列约占EST总数的36．8％。利用blastx程序，在蛋白质水平上与登录在NCBI非冗余蛋白质数据库(fir)中的序列逊行比对后发现，1232个contig即1810条EST在数据库中可以找到同源物，r’I有效EST总数的76．3％。比划分值小于80及没有同源物的部分与estothers数据库进行比对后，又有295个contig即432条EST可以找到同源EST，剩余的114个contig

5、即13l条EST仍然不能找到同源EST序列，这部分序列可认为是首次报道的EST序列。物利，来源上看，虽然功能已知的同源蛋白质中，来自拟南芥的占有绝大多数，但与estothers数据库进行比对后，同源性最高的EST中只有51％来自拟南芥。说明结球n菜与拟南芥的基因表达模式存在较大差别。这部分相似性较低的序列，对于研究结球白菜独特的发育和代谢途径以及进行遗传作图具有特殊的意义。同源物功能已知部分参照拟南芥研究中的方法，根据其同源蛋白的生物学作用或生化功能分类，发现参与蛋白质合成的基因数量最多(22．5％)，其次

6、是参与能量代谢(15．7％)、细胞防卫(12．2％)、信号转导(7．1％)、细胞结构(6．9％)、初级代谢(6．6％)、蛋白质修饰和加工储藏(6．4％)等途径的基因。与几种已发表的双子叶植物叶片EST的功能分类研究比较后发现，在结球白菜结球叶中参与蛋白质合成过程的蛋白质所占比例最大，而不像其它双子叶植物叶片EST研究中以参与能量代谢过程的蛋白质占绝对优势。推测这种表达模式的差异可能与白菜生长环境变化(如低温胁迫)及结球叶的旺盛生长有关。通过提高反应混合物中引物和dNTP的浓度，对cDNA的全面扩增技术(Po

7、lyAPCR)作了进一步的优化。杂交实验显示，白菜莲座期后期及结球期中期叶片eDNA的扩增产物保持了起始mRNA的浓度比例关系，可以用于后续杂交分析。利用载体两端通用引物，对所有挑选出的1438个eDNA克隆的质粒进行了PCR扩增，按照基因功能模块分类，利用Bio．Rad公司的96孔Bio．dot点膜工具先后共点制了16对尼龙膜，并以标记的eDNA扩增产物作为探针对所有尼龙膜进行了杂交分析。分析杂交结果，发现152个杂交点在莲座期与结球中期叶片中表达量上有较明显差异，其中94个为候选结球期上调表达类型，其余

8、58个为结球期候选下调表达类型。功能己知部分的候选基因中，表达水平上调部分主要集中于两类反应途径：一是泛素蛋白／26S蛋白酶体途径，二是低温胁迫抗逆反应途径。推测结球期植株体内激素水平的改变和外界环境温度的下降可能是导致两类反应途径基因表达水平改变的主要原因。Northern杂交验证候选基因中的类金属硫蛋白及一功能未知基因，结果与点杂交一致，即前者在结球期呈现出上调表达模式，而后者呈现出下调表达模式。同时还获得了