视网膜新生血管形成时紧密连接蛋白CLAUDINS表达的时空变化的研究

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1、中山大学硕士学位论文视网膜新生血管形成时紧密连接蛋白Claudins表达的时空变化的研究姓名：肖伟申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：罗燕20100526中山大学硕，l二学位论文中文摘要和脑组织提取RNA，用RT-PCR检测紧密连接蛋白Claudins的mRNA表达水平。提取P8、ll、13、15、18和2l天小鼠视网膜组织RNA，实时荧光定量RT-PCR检测视网膜发育过程中ClaudinsmRNA表达的动态变化。P18小鼠眼球冰冻切片免疫荧光染色检测紧密连接蛋白Claudin．1~-5，一7，一12和-23在视网膜的分布，Pl8小鼠免疫荧光视

2、网膜全层铺片检测Claudin-I、．2和．5在视网膜深、浅层血管的表达与分布。结果：在正常P18天和6周龄成年小鼠视网膜组织中均能检测到多种Claudins基因mRNA水平的表达。其中表达最高的是Claudin一5、．12和．23，其次是Claudin．1叫、．7、．9、．10、．1l、．19、-20和一22，与P18小鼠相比，6周龄成年小鼠中Claudin．1、．2、-4、．9和．19表达降低，而Ciaudin．18表达增高。作为阳性对照标本的6周龄小鼠肾脏和脑组织中检测到多种Ciaudins的表达，但四种组织中均未检测到Claudin-6的表

3、达。在正常小鼠视网膜发育过程中，mRNA表达变化超过2倍的有Claudin—l～5、．7、．12，．14~．17，．22和一23。P18小鼠冰冻切片免疫荧光染色显示Claudin-1、．2、-4和．5均分布在神经节细胞层(GCL)、内丛状层(IPL)和外丛状层(OPL)，Claudin-4的分布与lsolectinB4没有共定位，而Claudin．1、．2和．5均与lsolectinB4呈共定位分布。Claudin一3和一23仅在神经节细胞层中检测到表达，Claudin一12仅分布在外丛状层，Claudin．3、．12和．23均不与Isolecti

4、nB4呈共定位分布。视网膜冰冻切片免疫荧光未检测到Claudin-7的表达。视网膜铺片免疫荧光染色显示P18小鼠视网膜深层浅层血管网上均有Claudin—l、．2和．5的表达，呈线性均匀分布。结论：从P8至P2l，伴随视网膜的发育，Claudin．1、．2、．3、4、．5、．12和一23的mRNA呈先增高后降低的动态表达趋势，其中Claudin．1、．2和．5分布在视网膜深浅两层各级血管上，对于血．视网膜内屏障功能具有重要作用，而不分布在血管上的Ciaudin．3、-4、．12和．23则可能对视网膜神经发育具有重要作用。Il中山大学硕士学位论文中文

5、摘要第二部分Ciaudins在氧诱导的小鼠血管增殖性视网膜病变中的差异表达目的：探讨OIR小鼠视网膜新生血管形成时血．视网膜内屏障的功能状态以及Claudins表达和分布的特点。方法：用C57BL／6J乳鼠建立氧诱导视网膜病变(oIR)模型，于出生后7天将乳鼠随同母鼠放入含氧体积分数为75％的养箱中饲养5天，P12放回到正常大气环境中继续饲养5天。于P18行FITC．Dextran心脏灌注及伊文思蓝腹腔注射视网膜铺片分别检测OIR成模情况和OIR小鼠视网膜内屏障功能。PIg行腹腔注射伊文思蓝测定视网膜组织中染料含量，定量检测视网膜内屏障功能。P8、

6、Pll、P13、P15、P18和P21提取视网膜组织RNA和蛋白，分别行实时荧光定量PCR和Westernblot检测Ciaudins的mRNA和蛋白表达的动态变化，P18行视网膜铺片免疫荧光染色激光共聚焦扫描显微镜检测Claudin-1、．2和．5的空间分布特点。结果：FITC—Dextran灌注视网膜铺片显示P18天时，OIR小鼠视网膜出现大量新生血管生成伴视乳头周围无灌注区形成，伊文思蓝腹腔注射视网膜铺片显示P18天OIR小鼠视网膜中大片染料渗漏，定量检测OIR小鼠视网膜中染料含量为(20．47+6．73)ggxglxhxlxg"‘，而正常小

7、鼠视网膜中染料含量为(1．75+1．08)ggxlxlxhxgg"1，其差别具有统计学意义。实时荧光定量PCR检测到Claudin．1～．4、一7、．12和．23在OIR和正常小鼠视网膜中的表达存在差异；Westernblot显示在正常和O

8、R小鼠视网膜中，Claudin．2和．5的蛋白表达水平均呈先增高后降低的趋势，Claudin-2和．5在P18达到高峰，与正常小鼠相比较，OIR小鼠视网膜中Claudin．1的表达在P8至P21各个时间点的差别均无统计学意义，Claudin．2和．5在P15、P18和P21均表现升高，其差别具有统计学意义。视网

9、膜铺片激光共聚焦显微镜扫描显示正常P18小鼠视网膜血管网上这三种紧密连接蛋白的分布具有一致性，它们均匀分布在各级血管上，呈