紧密连接蛋白occludin和zo1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达的论文

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1、紧密连接蛋白occludin和ZO1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达的论文【摘要】目的：研究紧密连接蛋白occludin，zo1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达.方法：成年健康杂色豚鼠，耳廓反射灵敏，分别取耳蜗、脑、肺三组组织，免疫组织化学法及g/kg)腹腔麻醉，新鲜配置的40g/l多聚甲醛灌注后断头，取出双耳听泡，刺开蜗尖及圆窗膜，灌注蜗尖数次，将耳蜗取出置入40g/l多聚甲醛中，4℃中放置24h后100g/ledta脱钙14d，同时取脑皮质及肺组织投入40g/l多聚甲醛中24h后700ml/

2、l乙醇室温保存.石蜡包埋后沿蜗轴行平行切片,切片厚度5μm，取三种组织的三套石蜡切片分别进行antizo1，antioccludin和阴性对照染色切片，脱蜡、水化，pbs洗后分别加入一抗（zymedlaboratories，美国），包括zo1兔多克隆抗体（1∶100）及occludin兔多克隆抗体（1∶100），4℃过夜；pbs洗；滴加羊抗兔二抗（sigma，美国，1∶200），37℃孵育2h；滴加链霉素卵白素过氧化物酶（abc），37℃孵育1h，pbs冲洗；dab显色，自来水冲洗，脱水

3、，透明，封片，在光镜下观察.阴性对照实验采用pbs代替一抗，其余步骤同上.1.2.2g/kg)腹腔麻醉后迅速断头，取出双耳听泡，在体视显微镜下迅速取出耳蜗外侧壁血管纹，同时取出脑皮质及肺，mol/ltris,ph7.4,nacl,naf,焦磷酸钠，蔗糖，plete,mini,edtafree药片（rochediagnostics，德国），冰上充分匀浆，12000g，4℃，离心5min，收集上清.考马斯亮蓝检测三组蛋白的含量.按照每泳道5μg加载于sdspage凝胶电泳孔中，以恒压120v/4

4、0ma电泳至溴酚蓝到达凝胶底边.恒流300ma转印于nc膜上.丽春红染色，tbst缓冲液配置的50g/l脱脂奶粉室温下封闭2h.三组分别加入兔抗豚鼠zo1一抗（1μg/ml），兔抗豚鼠occludin一抗（2mg/l,zymedlaboratories，美国）及兔抗actin（santacruz,美国，1∶200），4℃过夜，tbst缓冲液洗膜2次，每次10min，tbs缓冲液洗膜1次，10min，加入hrp标记的二抗（北京中衫,1∶5000）,37℃孵育1h，洗膜3次，每次10min.ecl

5、化学发光系统（pierce）检测occludin，zo1及βactin的蛋白表达水平.分析阳性条带的分子量大小，用tanon高清晰度计算机图像分析系统进行灰度扫描分析，根据信号的强弱分析蛋白的表达量.以目的条带与βactin内参条带灰度的比值代表蛋白质表达水平.统计学处理：数据均用x±s表示，采用spss13.0统计软件，应用oner220000，60000，43000出现阳性条带.计算机灰度扫描软件分析灰度值（图3）.3讨论正常耳蜗微血管内皮细胞通透性对保证blb微环境的稳态具有决定性

6、的意义.耳蜗微血管内皮细胞在形态及结构上具有其特殊性：①具有大量的紧密连接；②大部分毛细血管内皮细胞为连续的无窗型内皮；③胞质内胞饮小泡少.以上几点提示耳蜗微血管内皮细胞对于物质的通透具有选择性，维持内、外淋巴液的正常循环.紧密连接（tjs）蛋白的高浓度表达是血管内皮细胞的结构特征及功能基础.tjs主要由跨膜蛋白和胞质附着蛋白组成.跨膜蛋白occludin是第一个被发现的tjs蛋白［2］，序列分析其mr为60000，仅在屏障内皮细胞高表达.它含有四个跨膜区，相邻细胞通过外环以拉链形式相互结合从而

7、产生细胞旁封闭.其n端对tjs的装配和屏障功能的保持起重要作用;c端与zo1直接相连，与zo1共同调节紧密连接的结构变化，这一特点对occludin在tjs间的定位及细胞间的通透性调节非常重要［3］.tjs蛋白zo(zonulaoccludensproteins)是第一个被证实的tj附着蛋白，属于膜相关鸟氨酸激酶(maguk)家族，主要包括三个亚型，这一家族在胞质内有多个结合位点.zo与occludin的c端及claudins相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一起，并能识别tjs位置及传递

8、各类信号.zo1mr为220000，它通过occludin位于胞质内的c2端直接相连［4］,zo1还可与肌动蛋白和jams蛋白相互作用，在细胞间tjs中起纽带作用.zo1可位于多种上皮细胞和内皮细胞的闭锁小带中，它可以敏感地反应出病理情况下屏障的损害，是检测内皮细胞屏障结构和功能的良好指标［5］.occludin和zo1的表达和分布与血管内皮细胞的通透性密切相关，其下调时血管的通透性增加，其上调时血管的通透性降低，渗漏减少［6-7］.tjs蛋白的装配和改变涉及体内许多信号传导机制.细胞间