caspase3在白色和杂色豚鼠脉冲噪声损伤耳蜗中的表达论文

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1、Caspase3在白色和杂色豚鼠脉冲噪声损伤耳蜗中的表达论文何青莲熊敏李云英石灵春谭敏李华【摘要】【目的】观察Caspase3在暴露于脉冲噪声中的白色和杂色豚鼠耳蜗中的表达，以探讨黑色素对耳蜗损伤的保护作用机制。【方法】选用白色和杂色豚鼠各8只，暴露于脉冲噪声中复制耳蜗损伤模型。取耳蜗用石蜡包埋、切片，采用免疫组织化学法观察Caspase3在两组豚鼠耳蜗的表达。【结果】Caspase3在两组脉冲噪声暴露豚鼠耳蜗中均呈阳性表达，以血管纹和螺旋神经节的表达较强，而且Caspase3在白色豚鼠耳蜗的表达显著强于杂色豚鼠。【

2、结论】耳蜗黑色素拮抗耳蜗损伤的作用是通过抑制耳蜗Capase3活性，从而抑制耳蜗细胞的凋亡来实现的。【关键词】耳蜗疾病；耳蜗/病理学；细胞凋亡；黑色素；疾病模型，动物；豚鼠研究表明.freela公司产品；86式自动步枪来源于广东省军区军训靶场；PathfinderI型听功能测试仪（Nicolet）。1.3造模方法［56］脉冲噪声发生源为86式自动步枪，脉冲噪声发生环境为军训靶场，将豚鼠置于距步枪口15cm处，测得该处声压为170dB。步枪连续激发6发，每次激发间隙10s。1.4听觉脑干诱发电位（ABR）检测ABR阈值采用P

3、athfinderI型听功能测试仪记录，短声刺激，声音由耳机通过与豚鼠外耳道耦合的塑料小管输入，以第3波为基准反应阈，测定两组豚鼠造模前及造模后24h的听阈值。1.5取材最后1次检测ABR后，豚鼠在全麻下开胸，以磷酸盐缓冲液（PBS）心脏灌流，在灌流液清亮时，改用40g/L多聚甲醛灌注固定5min。迅速取下双侧颞骨，将耳蜗置于4℃、40g/L多聚甲醛液中，在解剖显微镜下摘除镫骨，用细针于蜗顶钻1小孔，轻轻以40g/L多聚甲醛灌流耳蜗，耳蜗在多聚甲醛中固定12h以上，PBS漂洗数次，100g/L乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙，石蜡

4、包埋，切片，每片厚度6μm。1.6Caspase3表达检测采用免疫组织化学染色法。两组豚鼠耳蜗切片以二甲苯及酒精脱石蜡后，Tris缓冲盐溶液（TBS）漂洗10min×3次，体积分数2%双氧水处理20min；TBS漂洗10min×2次，2g/LTritonX处理10min；TBS漂洗10min×3次，50g/L胎牛蛋白封闭60min；加抗Caspase3抗体（以8g/L胎牛蛋白稀释为1∶600），在4℃冰箱过夜；加入二抗（羊抗兔，用TBS稀释为1∶400）1h，TBS漂洗后加入链球菌过氧化物酶（StrepHRP，用TBS

5、稀释为1∶100）1h，TBS漂洗10min×4次后，用二氨基联苯胺（DAB）显色液显色，显色在光镜下控制进行。阴性对照以8g/L胎牛蛋白代替抗caspase3抗体，以庆大霉素损伤豚鼠肾脏切片为阳性对照。1.7统计学方法采用SPSS11.5软件进行统计学分析。2结果2.1两组豚鼠ABR听阈变化比较由表1可知，两组豚鼠在脉冲噪声暴露后ABR听阈比较具有显著性差异（P＜0.01），杂色豚鼠的平均听阈比白色豚鼠约低17dB左右。表1两组豚鼠ABR听阈变化比较统计方法：t检验；①Ｐ＜0.01，与杂色组比较2.2Caspase3在耳

6、蜗的表达Caspase3在两组豚鼠耳蜗反应均呈阳性，阳性区域主要位于耳蜗血管纹和螺旋神经节，而且在耳蜗的各转都呈阳性，Caspase3在白色豚鼠耳蜗的表达明显强于杂色豚鼠。在Corti氏器，支持细胞如：Hensen细胞、Deiter细胞、内外柱细胞、边缘细胞Caspase3反应呈弱阳性；感觉细胞（内、外毛细胞）Caspase3染色亦呈弱阳性，外毛细胞染色较内毛细胞稍强。蜗神经的Caspase3染色在光镜下呈阴性。Caspase3在血管纹和螺旋神经节细胞的表达呈强阳性，且其表达在白色豚鼠（图1-a,b）和杂色豚鼠（图

7、1-c，d）差异显著。Caspase3在两组豚鼠耳蜗的表达强度见表2，并对Caspase3的表达强度以＋～＋＋＋表示进行半定量分析［7］。表2两组豚鼠Capase3耳蜗表达比较统计方法：秩和检验；①Ｐ＜0.05，与杂色组比较3讨论噪声能导致耳蜗的损伤，其损伤包括机械性和代谢性两种机制，一般认为先有机械性损伤，之后继发代谢性损伤。杂色豚鼠耳蜗黑色素能拮抗噪声对耳蜗的损伤作用，但是黑色素拮抗耳蜗损伤的作用机理不清楚。研究证实Caspase3在正常的耳蜗中不表达，但Caspase3是参与噪声耳蜗损伤的主要病理因素之一［8］

8、。本研究结果表明Caspase3在脉冲噪声损伤耳蜗中表达阳性，尤以血管纹和螺旋神经节细胞为甚，而且Caspase3在杂色豚鼠耳蜗的表达强度显著低于白色豚鼠耳蜗的表达强度，表明杂色豚鼠耳蜗黑色素可能通过代谢途径抑制Caspase3活性，从而拮抗豚鼠耳蜗的损伤。Caspas