谈连翘酯苷对顺铂作用后豚鼠耳蜗caspase

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1、谈连翘酯苷对顺铂作用后豚鼠耳蜗Caspase顺铂是治疗头颈部及泌尿生殖系统恶性肿瘤的首选药物之一，内耳毒性是其主要不良反应，一旦发生，将严重影响患者生活质量，目前尚无有效的防治及拮抗手段。连翘酯苷是中草药连翘主要的有效成分，具有显著的抗氧化、抗微生物感染和清除自由基、减轻过氧化损伤的作用。然而，连翘酯苷能否通过清除耳蜗氧自由基，从而对顺铂的耳毒性起防护作用，尚未见报道。2012年8月～2013年6月，本实验在建立顺铂导致豚鼠耳损伤模型的基础上，观察连翘酯苷对顺铂耳毒性的防护作用。　　1材料与方法　　1

2、.1材料　　30只健康豚鼠，体质量250～300g，雌雄不限，所有动物耳廓反射灵敏，由中国医科大学实验动物中心提供;注射用顺铂(10mg/支，齐鲁制药厂，批号0211003)，连翘酯苷冻干粉(天津一方科技有限公司，批号100225);兔抗Caspase-3多克隆抗体(SantaCruz公司)，生物素标记羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司);二乙基焦碳酸盐(DEPC，美国SIGMA公司)，Trizol试剂(北京鼎国生物公司)，OligodT引物(北京奥科生物技术公司合成)，LB563BEA型耳声

3、发射分析测试系统(IHC公司，美国)。　　1.2方法　　1.2.1分组与处理随机分为对照组、顺铂组和连翘酯苷组各10只。动物自由食水，自然光照周期，稳定1周后用于实验。顺铂组:将注射用顺铂用10mL生理盐水溶解成1mg/mL溶液备用，每天腹腔注射顺铂8mg/kg，连续7d;对照组:以生理盐水代替顺铂溶液注射，连续7d;连翘酯苷组:在注射顺铂前30min，腹腔注射连翘酯苷25.0mg/(kgd)，连续7d。　　1.2.2畸变产物耳声发射(DPOAE)检测在隔音室内，将豚鼠以戊巴比妥腹腔注射麻醉(50mg

4、/kg)，采用LB563BEA型耳声发射分析测试系统进行DPOAE检测。选择初始纯音f1与f2，f1/f2=1.22，强度差L1-L2=10dBSPL，取DPOAE幅值超过本底噪音3dB为DPOAE检出标准，测试频率f20=f1f2为1、2、4、6、8kHz处的幅值。　　1.2.3耳蜗组织Caspase-3蛋白检测采用in，3次;二抗(1∶2000)室温孵育2h，TTBS洗涤10min，3次;ECL显影并扫描测光密度值。　　1.2.4耳蜗组织Caspase-3mRNA检测采用逆转录聚合酶链反应(RT-

5、PCR)法。将豚鼠麻醉处死，剥离出双侧耳蜗;按RNAout说明书提取总mRNA，然后以逆转录(RT法)先合成cDNA，再进行PCR扩增;Caspase-3的上游引物:5'-CTGCCGGAGTCTGACTGGAA-3';下游引物:5'-ATCAGTCCCACTGTCTGrCTCAATG-3'，扩增产物全长649bp;β-actin的上游引物:5'-GAGACCTTCAACACCCAGCC3';下游引物为:5'-GCGGGGCATCGGA

6、ACCGCTCA-3'，扩增产物全长374bp。反应条件:95℃预变性1min、95℃变性15s、58℃退火15s、72℃延伸45s，进行45个循环。UVP凝胶显像仪扫描并进行图像分析。用目的基因与β-actin吸光度的比值代表目的基因的相对表达量。　　1.2.5统计学方法采用SPSS18.0统计软件。计量结果用珋x±s表示，各组比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1动物一般情况顺铂组给药期间，活动减少，食欲减退，毛发稀疏脱落，体质

7、量减轻，反应迟钝;对照组小鼠无异常表现，耳廓反射灵敏，体质量略有上升;连翘酯苷组体质量无明显减轻，时有食欲减退现象。　　2.2DPOAE幅值检测结果与对照组相比，顺铂组在给予顺铂注射后DPOAE的幅值开始下降(P均<0.01)，给予连翘酯苷干预后DPOAE的幅值显著升高(P均<0.05)。　　2.3耳蜗组织Caspase-3蛋白表达情况顺铂组豚鼠耳蜗组织Caspase-3蛋白表达的相对光密度值为0.31±0.04，对照组为0.11±0.01，P<0.01;

8、连翘酯苷组为0.25±0.03，与顺铂组比较，P<0.05。　　3讨论　　顺铂为铂的金属络合物，是临床上最常用的抗肿瘤药物之一，主要对泌尿生殖系的膀胱、睾丸、卵巢及头颈部恶性肿瘤有效。但是，因为其严重的耳毒性和肾脏损害限制了其临床的应用范围和剂量。顺铂类药物的耳毒性通常表现为不可逆性、进展性、双侧性、由高频向低频逐渐受累，常伴耳鸣和眩晕。研究表明，顺铂产生耳蜗毒性的主要机制:①顺铂在内耳蓄积内耳排泄缓慢所致;②使毛细胞内线粒体变性，由