连翘酯苷对豚鼠顺铂耳毒性损伤的防护作用及机制探讨-论文.pdf

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1、山东医药2014年第54卷第11期连翘酯苷对豚鼠顺铂耳毒性损伤的防护作用及机制探讨赵安未，侯学东，富公弼(沈阳医学院附属奉天医院，沈阳110024)摘要：目的观察连翘酯苷对豚鼠顺铂耳毒性损伤的防护作用，并探讨其机制。方法30只豚鼠随机分为3组各10只，顺铂组及连翘酯苷组豚鼠每天腹腔注射顺铂8mkg，连续7d；连翘酯苷组在每天腹腔注射顺铂前30rain，腹腔注射连翘酯苷25．0mg／(kg·d)；正常组同法腹腔注射生理盐水。给药后第8天，采用LB563BEA型耳声发射分析测试系统对处于麻醉状态的豚鼠进行畸变产

2、物耳声发射(DPOAE)幅值检测；后处死动物，取材，采用免疫组化法和Westernblot法检测各组豚鼠耳蜗蛋白激酶B(p-Akt)蛋白。结果与正常组比较，顺铂组测试频率2、4、6、8kHz处DPOAE幅值降低(P<0．01)；与顺铂组比较，连翘酯苷组测试频率2、4、6、8kHz处DPOAE幅值升高(P<0．05)。与正常组比较，顺铂组豚鼠耳蜗p-Akt蛋白水平降低(P<0．01)；与顺铂组比较，连翘酯苷组p-Akt蛋白表达水平明显升高(P<0．05)。结论连翘酯苷对豚鼠顺铂耳毒性损伤有防护作用，其机制可能

3、与上调p-Akt表达有关。关键词：连翘酯苷；耳毒性损伤；蛋白激酶Bcloi：10．3969／j．issn．1002—266X．2014．11．011中图分类号：R764．5文献标志码：A文章编号：1002-266X(2014)11-0035-03顺铂是治疗头颈部及泌尿生殖系统恶性肿瘤的量250—300g，雌雄不限，所有动物耳廓反射灵敏。化疗药物，除了可以直接杀伤肿瘤细胞外，还可诱导由中国医科大学实验动物中心提供。随机分为对照肿瘤细胞进入凋亡程序j。但是，顺铂与耳蜗组织组、顺铂组和连翘酯苷组各1O只。动物自由

4、食水，结合后可激发产生大量的自由基，诸如超氧化物、过自然光照周期，稳定1周后用于实验。顺铂组及连氧化氢、毒性脂质过氧化物等，这些氧自由基的增加翘酯苷豚鼠每天腹腔注射顺铂8mg／kg，连续7d；可引起耳蜗毛细胞内的钙离子浓度增高并因此而导连翘酯苷组在每天腹腔注射NCA溶液30min前，腹致毛细胞凋亡_2；同时，顺铂还可明显降低耳蜗组腔注射连翘酯苷25．0mg／(kg·d)，连续7d；正常织中抗氧化酶类的活性，产生内耳毒性J。连翘酯组以生理盐水代替顺铂溶液注射，连续7d。实验期苷是连翘属植物中的咖啡酰糖苷类中主

5、要有效成分间所有动物均在安静状态下饲养并给予常规饮食。之一，其具有显著的抗氧化、抗微生物感染和清除自1．3畸变产物耳声发射(DPOAE)幅值检测在隔音由基、减轻过氧化损伤的作用。然而，连翘酯苷是否室内，豚鼠以戊巴比妥腹腔注射麻醉(50mg／kg)，采用对顺铂的耳毒性起防护作用，尚未见报道。本研究LB563BEA型耳声发射分析测试系统(IHC公司，美国)观察了连翘酯苷对豚鼠顺铂耳毒性损伤的防护作对处于麻醉状态的豚鼠进行DPOAE检测。选择初始用，并探讨其机制。纯音f与f2，fl／f2=1．22，强度差L一=1

6、0dBSPL，1材料与方法取DPOAE幅值超过本底噪音3dB为DPOAE检出标1．1试剂及仪器注射用顺铂(i0mg／支，齐鲁制准，测试频率ro=fl×f2为1、2,4、6、8kHz处的幅值。药厂)，连翘酯苷冻干粉(天津一方科技有限公司)，1．4耳蜗组织p-Akt蛋白表达检测①免疫组化兔抗蛋白激酶B(p-Akt)多克隆抗体(Santa—Cruz公法：将豚鼠麻醉，先用生理盐水从左心室灌注，同时司)，生物素标记羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技剪开右心房。当右心房流出清亮液体后，再用10％术有限公司)，二乙基焦碳酸

7、盐(Sigma公司)，TRIzol中性缓冲甲醛灌注固定。断头剥离耳蜗，甲醛固定试剂(北京鼎国生物公司)，OligodT引物(由北京奥过夜，用0．4mol／LEDTA(pH值7．2)脱钙7d。常科生物技术公司合成)，LB563BEA型耳声发射分析规石蜡包埋，平行于蜗轴方向切片，按sP试剂盒说测试系统(IHC公司)。明书测定p-Akt表达，采用图像分析软件计算光密1．2动物分组及处理选用30只健康豚鼠，体质度值。②Westernblot法：将豚鼠麻醉处死，剥离出35山东医药2014年第54卷第11jg双侧耳蜗，

8、置于4℃预冷的PBS中。在解剖显微镜下剥离蜗壳，取出耳蜗组织(基底膜及血管纹)，剪碎，加入组织裂解液中，4qC下匀浆，离心取上清，Bradford法测定蛋白浓度，等量蛋白样品经SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转印、4封闭过夜，一抗p-Akt(1：200)和B-actin(1：400)室温孵育2h，TrBS洗涤10min，3次，二抗(1：2000)室温孵育2h，TIP—BS洗涤10rain，3次，ECL影并扫描测光