连翘酯苷a抗内毒素作用及作用机制的实验研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：I珏签字日期：翮乡年多月7日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅

2、。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名(手写)：f魏导师签名(手写)：佬鼍弩码签字日期：如717年6月7日签字日期：棚>年‘月7日摘要目的：观察连翘酯苷A(ForsythosideA，FA)对LPS诱

3、导巨噬细胞(RAW264．7)12h后细胞生存率、TLR4、MyD88、NF．rd3、TNF．0【表达的影响及对内毒素血症急性肺损伤小鼠血浆ET和TNF．a水平、肺组织病理及TLR4、MyD88和NF．1cB表达的变化，探讨连翘酯苷A抗内毒素作用及其可能机制。方法：1．连翘酯苷A对LPS作用的巨噬细胞TLR4信号通路的影响1．1实验分组：实验共分6组，分别为control组，LPS组，连翘酯苷A高、中、低剂量组(FAl、FA2、FA3)及多黏菌素B组(PMB)；control组：细胞常规培养；LPS组：加入100ng／mlLPS，

4、常规培养12h；FAl、FA2、FA3和PMB组：分别加入FA320ug／ml、80ug／ml、20ug／ml及PMBloug／ml预处理RAW264．7细胞2h后，再给予100ng／mlLPS，培养12h。1．2各项指标的检测：@MTT法检测各组细胞存活率；@RT-PCR方法检测各组细胞中TLR4和MyD88mRNA的表达；③Westernblot法检测各组细胞中TLR4、MyD88和NF．rd3蛋白的表达；@ELISA法检测各组细胞上清中TNF．0【的含量。2．连翘酯苷A对内毒素血症急性肺损伤小鼠的保护作用2．1模型建立：采用

5、腹腔注射内毒素(10mgJkg)建立内毒素血症急性肺损伤小鼠模型；2．2实验分组：48只雄性SPF级BALB／C小鼠随机分成六组：正常对照组(A组)、急性肺损伤模型组(B组)、抗体组(C组)、连翘酯苷A高、中、低剂量组(D、E、F组)；其中连翘酯苷A干预组在造模前7天开始腹腔给药，每天一次，分别给予FA80mg／kg、20mg／kg和5mg／kg，抗体组在造模前12h前腹腔注射Anti-TLR4／MD2抗体50ug／209。各组小鼠在造模4h后留取血和肺组织。2．3各项指标的观察和检测：①动态浊度法检测血浆内毒素水平；@HE染色法

6、观察小鼠病理组织学变化；③RTPCR方法检测肺组织中TLR4mRNA的表达；QWestemblot法检测肺组织TLR4蛋白的表达；⑤免疫组化法检测肺组织摘要MyD88和NF．vd3蛋白的表达；OELISA法检测血清中TNF．0【的表达；结果：1．连翘酯苷A对LPS作用的巨噬细胞TLR4信号通路的影响1．1MTT法检测结果：与control组比较，LPS(100ng／m1)组细胞存活率显著下降；FAl、FA2、FA3剂量预处理均能明显提高细胞存活率(P<0．01)，并呈剂量依赖关系；FAl组与PMB组比较无显著性差异。1．2TLR4

7、mRNA和蛋白的表达：control组RAW264．7细胞只表达少量TLR4，给予LPS刺激12h，TLR4表达明显升高(P<0．01)，FAl、FA2、FA3预处理均可明显降低TLR4的表达，并呈剂量依赖关系。1．3MyD88和NF．KB蛋白的表达：与control组比较，LPS组的表达明显上调(p<0．01)，FA各剂量组均能不同程度减轻上述变化，以高剂量组作用最为明显。1．4TNF．n的水平：给予LPS刺激后，培养上清中TNF．0c的含量表达明显升高(P<0．01)，FA预处理均可降低TNF．0【的分泌，并呈剂量依赖关系。2

8、连翘酯苷A对内毒素血症急性肺损伤小鼠的保护作用2．1一般情况改变：造模后，小鼠出现精神萎靡，懒动，厌食，大小便失禁。FA各组用药后与模型组比较有明显改善。2．2各项检测指标结果：与正常组相比，模型组血浆中内毒素含量显著升高(P<0．01)，肺组织有