诱生型一氧化氮合酶在白色和杂色豚鼠脉冲噪声损伤耳蜗中的表达

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1、诱生型一氧化氮合酶在白色和杂色豚鼠脉冲噪声损伤耳蜗中的表达作者：何青莲,熊敏,李云英　石灵春,谭敏,李华【摘要】【目的】观察诱生型一氧化氮合酶(iNOS)在脉冲噪声暴露白色和杂色豚鼠耳蜗中的表达,以探讨黑色素对耳蜗损伤的保护作用机理。【方法】将白色和杂色豚鼠暴露于脉冲噪声,复制耳蜗损伤的模型。采用免疫组织化学的方法观察iNOS在两组豚鼠耳蜗的表达。【结果】iNOS在两组脉冲噪声暴露豚鼠耳蜗中均呈阳性表达,以血管纹和螺旋神经节的表达较强,而且iNOS在白色豚鼠耳蜗的表达显著强于杂色豚鼠。【结论】耳蜗黑色素拮抗耳蜗损伤的作用可能是通过抑

2、制耳蜗iNOS表达来实现的。【关键词】耳蜗/损伤;耳蜗/病理学;脉冲噪声;黑色素;疾病模型，动物;豚鼠一氧化氮(nitricoxide,NO)有多种生物学作用,由L精氨酸在一氧化氮合成酶(nitricoxidesynthase,7NOS)的催化作用下产生。有研究表明诱生型NOS(iNOS)参与噪声的耳蜗损伤机制[1],而黑色素对杂色豚鼠耳蜗的损伤有拮抗作用[2]。目前有关黑色素拮抗豚鼠耳蜗损伤的机理尚不清楚[3],本研究应用免疫组织化学方法观察iNOS在脉冲噪声暴露损伤白色和杂色豚鼠耳蜗的表达,以探讨黑色素是否通过抑制iNOS的表

3、达而拮抗耳蜗损伤。现报道如下。　　1材料与方法　　11实验动物选用健康白色红目豚鼠(白色组)和杂色豚鼠(杂色组)各8只,耳镜检查鼓膜正常,耳廓反射灵敏。豚鼠来源于广东省医学实验动物中心,3月龄,体质量250g左右,雌雄兼用,合格证号：0017410。　　12主要试剂与仪器抗iNOS抗体、链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒(SA1022)均为Sigma公司产品。86式自动步枪来源于广东省军区军训靶场，PathfinderI型听功能测试仪(Nicolet公司)。　　13造模方法[4-5]脉冲噪声发生源为86

4、式自动步枪,脉冲噪声发生环境为军训靶场,将豚鼠置于距步枪口15cm处,测得该处声压为170dB。步枪连续激发6发,每次激发间隙10s。　　14听觉脑干诱发电位(ABR)检测ABR阈值采用听功能测试仪记录,短声刺激,声音由耳机通过与豚鼠外耳道耦合的塑料小管输入,以第3波为基准测反应阈,测定脉冲噪声暴露前后听阈值。两组豚鼠在脉冲噪声暴露前及暴露后24h行ABR检测。7　　15取材最后1次检测ABR后,豚鼠在全麻下开胸,以磷酸盐缓冲液(PBS)心脏灌流,在灌流液清亮时,改用40g/L多聚甲醛灌注固定5min。迅速取下双侧颞骨,将耳蜗置

5、于4℃、40g/L多聚甲醛液中,在解剖显微镜下摘除镫骨,用细针于蜗顶钻一小孔,轻轻以40g/L多聚甲醛灌流耳蜗,耳蜗在40g/L多聚甲醛固定12h以上,PBS漂洗数次,100g/L乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙,石蜡包埋,切片,每片厚度6μm。　　16免疫组织化学染色两组豚鼠耳蜗切片以二甲苯及酒精脱石蜡后,Tris缓冲盐溶液(TBS)漂洗10min×3次,体积分数2%双氧水处理20min。TBS漂洗10min×2次后,2g/LTriton处理10min。TBS漂洗10min×2次,50g/L胎牛蛋白封闭60min。加抗iNOS抗体(

6、以8g/L胎牛蛋白稀释为1∶800,Sigma公司,从兔血清制备)，在4℃冰箱过夜。加入二抗(羊抗兔,用TBS稀释为1∶400)1h,TBS漂洗后加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(StrepHRP,用TBS稀释为1∶100)1h,TBS漂洗10min×4次后,用二氨基联苯胺(DAB)显色液显色,显色在光镜下控制进行。阴性对照以8g/L胎牛蛋白代替抗iNOS抗体,以庆大霉素损伤豚鼠肾脏切片为阳性对照。iNOS在两组豚鼠耳蜗的表达强度以+～+++表示进行半定量分析[6]。　　17统计学方法采用SPSS1175软件进行数据的统计学分

7、析。　　2结果　　21两组豚鼠ABR听阈变化由表1可知,两组豚鼠在脉冲噪声暴露后ABR比较差异具有显著性意义(P<001),杂色豚鼠的平均听阈比白色豚鼠约低17dB左右。表1两组豚鼠ABR听阈变化比较　　22两组豚鼠耳蜗iNOS表达比较　　iNOS在两组豚鼠耳蜗反应均呈阳性,而且在耳蜗的各转都呈阳性,iNOS在白色豚鼠耳蜗的表达明显强于杂色豚鼠。在Corti氏器,支持细胞如：Hensen细胞、Deiter细胞、内外柱细胞、边缘细胞iNOS反应均呈阳性。感觉细胞(内、外毛细胞)iNOS染色呈阳性,外毛细胞染色较强,内毛细胞

8、染色较弱。蜗神经的iNOS染色在光镜下呈阴性。图1结果显示：白色豚鼠耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞iNOS反应均呈强阳性(图1-a,b),杂色豚鼠耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞iNOS反应均呈弱阳性(图1-c,d)。iNOS在两组豚鼠耳蜗的表