caspase3在白色和杂色豚鼠脉冲噪声损伤耳蜗中的表达

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1、Caspase3在白色和杂色豚鼠脉冲噪声损伤耳蜗中的表达作者：何青莲熊敏李云英石灵春谭敏李华【摘要】【目的】观察Caspase3在暴露于脉冲噪声中的白色和杂色豚鼠耳蜗中的表达，以探讨黑色素对耳蜗损伤的保护作用机制。【方法】选用白色和杂色豚鼠各8只，暴露于脉冲噪声中复制耳蜗损伤模型。取耳蜗用石蜡包埋、切片，采用免疫组织化学法观察Caspase3在两组豚鼠耳蜗的表达。【结果】Caspase3在两组脉冲噪声暴露豚鼠耳蜗中均呈阳性表达，以血管纹和螺旋神经节的表达较强，而且Caspase3在白色豚鼠耳蜗的表达显著强于杂色豚鼠。【结

2、论】耳蜗黑色素拮抗耳蜗损伤的作用是通过抑制耳蜗Capase3活性，从而抑制耳蜗细胞的凋亡来实现的。【关键词】耳蜗疾病；耳蜗/病理学；细胞凋亡；黑色素；疾病模型，动物；豚鼠研究表明，黑色素对杂色豚鼠耳蜗的噪声损伤有保护作用［1］，但其抗损伤机制尚不完全清楚。细胞凋亡是耳蜗损伤的一种重要机制，而细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶类和信号传导途径调控的一个"瀑布式"激活过程［2］，Caspase家族（又称天冬酰胺特异酶切的半胱胺酸蛋白酶家族）是一切凋亡信号传导的共同通路，正由于此家族的激活最终导致内源性核酸酶的激活和细胞骨架重新组合所致的

3、细胞结构解体，形成不可逆的凋亡［3］。Caspase家族现有13名成员，其中Caspase3由于其具有的凋亡执行作用而成Caspase家族中的核心成员［4］，它的表达意味着细胞在发生凋亡。本研究应用免疫组织化学方法检测并比较Caspase3在白色和杂色豚鼠耳蜗的表达，以探讨耳蜗黑色素是否通过影响Caspase3活性而对耳蜗脉冲噪声损伤起拮抗作用。现报道如下。1材料与方法1.1动物采用健康白色红目豚鼠和杂色豚鼠各8只，耳镜检查鼓膜正常，耳廓反射灵敏。豚鼠来源于广东省医学实验动物中心，3月龄，体质量250g左右，合格证号：001

4、7410。1.2主要试剂与仪器抗Caspase3抗体（BA0588）、链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物（SABC）免疫组化试剂盒（SA1022）均为Sigma公司产品；86式自动步枪来源于广东省军区军训靶场；PathfinderI型听功能测试仪（Nicolet）。1.3造模方法［56］脉冲噪声发生源为86式自动步枪，脉冲噪声发生环境为军训靶场，将豚鼠置于距步枪口15cm处，测得该处声压为170dB。步枪连续激发6发，每次激发间隙10s。1.4听觉脑干诱发电位（ABR）检测ABR阈值采用PathfinderI型听功能测试仪记录，

5、短声刺激，声音由耳机通过与豚鼠外耳道耦合的塑料小管输入，以第3波为基准反应阈，测定两组豚鼠造模前及造模后24h的听阈值。1.5取材最后1次检测ABR后，豚鼠在全麻下开胸，以磷酸盐缓冲液（PBS）心脏灌流，在灌流液清亮时，改用40g/L多聚甲醛灌注固定5min。迅速取下双侧颞骨，将耳蜗置于4℃、40g/L多聚甲醛液中，在解剖显微镜下摘除镫骨，用细针于蜗顶钻1小孔，轻轻以40g/L多聚甲醛灌流耳蜗，耳蜗在多聚甲醛中固定12h以上，PBS漂洗数次，100g/L乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙，石蜡包埋，切片，每片厚度6μm。1.6Caspa

6、se3表达检测采用免疫组织化学染色法。两组豚鼠耳蜗切片以二甲苯及酒精脱石蜡后，Tris缓冲盐溶液（TBS）漂洗10min×3次，体积分数2%双氧水处理20min；TBS漂洗10min×2次，2g/LTritonX处理10min；TBS漂洗10min×3次，50g/L胎牛蛋白封闭60min；加抗Caspase3抗体（以8g/L胎牛蛋白稀释为1∶600），在4℃冰箱过夜；加入二抗（羊抗兔，用TBS稀释为1∶400）1h，TBS漂洗后加入链球菌过氧化物酶（StrepHRP，用TBS稀释为1∶100）1h，TBS漂洗10min×4

7、次后，用二氨基联苯胺（DAB）显色液显色，显色在光镜下控制进行。阴性对照以8g/L胎牛蛋白代替抗caspase3抗体，以庆大霉素损伤豚鼠肾脏切片为阳性对照。1.7统计学方法采用SPSS11.5软件进行统计学分析。2结果2.1两组豚鼠ABR听阈变化比较由表1可知，两组豚鼠在脉冲噪声暴露后ABR听阈比较具有显著性差异（P＜0.01），杂色豚鼠的平均听阈比白色豚鼠约低17dB左右。表1两组豚鼠ABR听阈变化比较统计方法：t检验；①Ｐ＜0.01，与杂色组比较2.2Caspase3在耳蜗的表达Caspase3在两组豚鼠耳蜗反应均呈阳性

8、，阳性区域主要位于耳蜗血管纹和螺旋神经节，而且在耳蜗的各转都呈阳性，Caspase3在白色豚鼠耳蜗的表达明显强于杂色豚鼠。在Corti氏器，支持细胞如：Hensen细胞、DEiter细胞、内外柱细胞、边缘细胞Caspase3反应呈弱阳性；感觉细