紧密连接蛋白occludin和zo1在豚鼠耳蜗

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1、紧密连接蛋白occludin和ZO1在豚鼠耳蜗【摘要】目的：研究紧密连接蛋白occludin，ZO1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达.方法：成年健康杂色豚鼠，耳廓反射灵敏，分别取耳蜗、脑、肺三组组织，免疫组织化学法及ini,EDTAfree药片（RocheDiagnostics，德国），冰上充分匀浆，12000g，4℃，离心5min，收集上清.考马斯亮蓝检测三组蛋白的含量.按照每泳道5μg加载于SDSPAGE凝胶电泳孔中，以恒压120V/40mA电泳至溴酚蓝到达凝胶底边.恒流300mA转印于NC膜上.丽春红

2、染色，TBST缓冲液配置的50g/L脱脂奶粉室温下封闭2h.三组分别加入兔抗豚鼠ZO1一抗（1μg/mL），兔抗豚鼠occludin一抗（2mg/L,ZymedLaboratories，美国）及兔抗actin（SantaCruz,美国，1∶200），4℃过夜，TBST缓冲液洗膜2次，每次10min，TBS缓冲液洗膜1次，10min，加入HRP标记的二抗（北京中衫,1∶5000）,37℃孵育1h，洗膜3次，每次10min.ECL化学发光系统（pierce）检测occludin，ZO1及βactin的蛋白表达水

3、平.分析阳性条带的分子量大小，用TANON高清晰度计算机图像分析系统进行灰度扫描分析，根据信号的强弱分析蛋白的表达量.以目的条带与βactin内参条带灰度的比值代表蛋白质表达水平.统计学处理：数据均用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件，应用Oner220000，60000，43000出现阳性条带.计算机灰度扫描软件分析灰度值（图3）.3讨论正常耳蜗微血管内皮细胞通透性对保证BLB微环境的稳态具有决定性的意义.耳蜗微血管内皮细胞在形态及结构上具有其特殊性：①具有大量的紧密连接；②大部分毛细血管内皮细胞为连

4、续的无窗型内皮；③胞质内胞饮小泡少.以上几点提示耳蜗微血管内皮细胞对于物质的通透具有选择性，维持内、外淋巴液的正常循环.紧密连接（TJs）蛋白的高浓度表达是血管内皮细胞的结构特征及功能基础.TJs主要由跨膜蛋白和胞质附着蛋白组成.跨膜蛋白occludin是第一个被发现的TJs蛋白［2］，序列分析其Mr为60000，仅在屏障内皮细胞高表达.它含有四个跨膜区，相邻细胞通过外环以拉链形式相互结合从而产生细胞旁封闭.其N端对TJs的装配和屏障功能的保持起重要作用;C端与ZO1直接相连，与ZO1共同调节紧密连接的结构变

5、化，这一特点对occludin在TJs间的定位及细胞间的通透性调节非常重要［3］.TJs蛋白ZO(zonulaoccludensproteins)是第一个被证实的TJ附着蛋白，属于膜相关鸟氨酸激酶(MAGUK)家族，主要包括三个亚型，这一家族在胞质内有多个结合位点.ZO与occludin的C端及claudins相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一起，并能识别TJs位置及传递各类信号.ZO1Mr为220000，它通过occludin位于胞质内的C2端直接相连［4］,ZO1还可与肌动蛋白和JAMs蛋白相互作用，

6、在细胞间TJs中起纽带作用.ZO1可位于多种上皮细胞和内皮细胞的闭锁小带中，它可以敏感地反应出病理情况下屏障的损害，是检测内皮细胞屏障结构和功能的良好指标［5］.Occludin和ZO1的表达和分布与血管内皮细胞的通透性密切相关，其下调时血管的通透性增加，其上调时血管的通透性降低，渗漏减少［6-7］.TJs蛋白的装配和改变涉及体内许多信号传导机制.细胞间TJs调节所涉及的信号传导分子主要有RhoGTP酶，Ca2+，NO，磷脂酶C，肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和蛋白激酶C(PKC)等.这些信号通路可以通过改变肌

7、动蛋白收缩性,影响细胞间TJs，使TJs蛋白如occludin和ZO1磷酸化、去磷酸化,调节其通透性［8-10］.本研究中，免疫组织化学染色后在光学显微镜下可见TJs蛋白occludin，ZO1在耳蜗外侧壁血管纹明显表达，ed，1980,98(9)：330-336．［2］FuruseM，FujitaK，HiiragiT，etal.Claudin1andclaudin2:Novelintegralmembraneproteinlocalizingatightjunctionilaritytooccludin

8、g［J］.CellBiol,1998,141：1539-l550．［3］KnieselU,olNeurobiol,2000,20:57-76.［4］MüllerSL,PortidtA,etal.Thetightjunctionproteinoccludinandthedherensjunctionproteinαcateninshareamoninteractionme