RNA干扰逆转胃癌细胞耐药性的研究

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1、上海交通大学硕士学位论文RNA干扰逆转胃癌细胞耐药性的研究姓名：张艳红申请学位级别：硕士专业：内科学（消化病学）指导教师：王兴鹏20080501上海交通大学硕士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日2上海交通

2、大学硕士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日3上海交通大学硕士学位论文RNA干扰逆转胃癌细胞耐药性的

3、研究摘要背景与目的：胃癌严重威胁着我国人民的健康，相当一部分病人因为肿瘤对化疗药物产生耐药性导致肿瘤无法控制而死亡。肿瘤耐药性的产生极大地限制了抗肿瘤药物疗效的发挥。RNAi可以作为一种简单有效的代替基因敲除的遗传工具，封闭目的基因的表达。从而使肿瘤细胞对化疗药物恢复敏感性，这对于提高肿瘤患者的化疗效果和延长患者生存期具有非常重要的意义。本实验将最新的RNA干扰技术应用于肿瘤化疗领域中最为关切的难题。选择MRP4这个重要的耐药相关蛋白作为靶点，设计针对于它的基因序列的特异性siRNA，通过慢病毒载体将其应用于

4、胃癌耐药细胞株，从而在体外研究RNA干扰逆转胃癌细胞耐药性的作用。方法：1.采用逐步递增DDP浓度方法诱导细胞耐药。MTS法测定化疗药物的细胞毒性作用，基因芯片筛选胃癌耐药相关基因，RT-PCR及Westernblot检测所筛选出的耐药株中高表达的MRP4基因的表达。2.针对MRP4基因设计4种RNAi靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pGCL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。用连接后的pGCL-GFP

5、，pHelper1.0(gag/pol元件)和Helper2.0(VSV-G元5上海交通大学硕士学位论文件)质粒共同转染到293T包装细胞内，荧光显微镜下观察包装细胞基因表达情况，收集病毒上清、浓缩、测定重组病毒滴度。将4种慢病毒重组载体LV-shMRP4分别感染胃癌SGC7901/顺铂耐药细胞，并进行Real-timePCR检测，筛选出包含最佳有效靶序列的慢病毒重组载体LV-shMRP4。3.含最佳有效靶序列的慢病毒重组载体LV-shMRP4感染胃癌SGC7901/DDP耐药细胞，RealTimePCR及W

6、esternblot分别检测感染前后MRP4基因在mRNA及蛋白水平的表达变化，AnnexinV-FIFC检测细胞凋亡情况，及MTS检测慢病毒重组载体LV-shMRP4抑制MRP4表达后SGC7901/DDP药物敏感性的改变。结果：1.胃癌SGC7901/DDP顺铂耐药细胞株中MRP4表达不管在mRNA水平还是在蛋白水平均高于胃癌SGC7901敏感细胞，与胃癌耐药存在重要相关性。2.成功构建了MRP4基因的慢病毒表达载体。3.慢病毒重组载体LV-shMRP4感染胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP后，MRP

7、4基因在mRNA水平及蛋白水平表达均明显下调；细胞耐药性明显降低，对化疗药物顺铂的敏感性显著升高；早期凋亡率明显高于耐药细胞。结论：慢病毒重组载体LV-shMRP4能够有效沉默MRP4基因，从而达到逆转胃癌耐药的目的。关键词胃癌，耐药，RNA干扰，慢病毒载体，MRP46上海交通大学硕士学位论文THESTUDYOFREVERSINGDRUGRESISTANCEBYRNAINTERFERENCEINGASTRICCANCERABSTRACTBackground:Thegastriccanceristhemostc

8、ommonmalignantcarcinomaandcharacteristicoflowearlydiagnosisrateandhighmortalityinChina.Nowadaysthegastriccancerpatientshavebenefitedfrommoresurvivaltimeandbetterlifequalitybyusingnewchemotherapeutics.H