葡萄糖神经酰胺合成酶小干扰rna逆转胃癌多药耐药的研究

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1、郑州大学2007届博士学位论文葡萄糖神经酰胺合成酶小干扰RNA逆转胃癌多药耐药的研究博士研究生：张艳导师：张钦宪教授郑州大学基础医学院郑州450052摘要胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的健康与生命，在其综合治疗中，化疗仍然占重要地位，许多因素可以影响化疗的效果，其中肿瘤的多药耐药(multidrugresistance，MDR)是化疗失败的主要原因之一。研究产生MDR现象的机制及克服的方法已成为肿瘤研究的重要课题。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对其它结构不同、作用靶位各异的抗肿瘤药物也产生耐药性。

2、以往已知MDR的相关机制很多，如P-糖蛋白口．gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)、热休克蛋白、肺耐药蛋I!I(LRP)的高表达，谷胱甘肽s．转移酶和谷胱甘肽升高，拓扑异构酶活力降低，凋亡抑制以及肿瘤细胞某些生化特征的改变等。新近又发现葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosyleeramidesynthase，c,cs)高表达与肿瘤MDR密切相关。GCS是一种葡萄糖转移酶，参与神经酰胺的代谢，可催化UDP．glucose上的糖基转运到神经酰胺生成葡萄糖神经酰胺(glucosy!ccramide，Glcc啪，使细胞逃避神经酰胺介导的凋亡作用

3、而产生MDR。神经酰胺是鞘脂类代谢的主要分子，在诱导细胞凋亡中起着重要作用，是介导细胞凋亡的第二信使，它在多种信号转导过程中发挥广泛的作用，其糖基化代谢产物GleCer是细胞合成其他鞘糖脂的前体物质，它与肿瘤细胞的生物学行为密切相关，不仅维持着细胞的正常结构功能，还参与了细胞增殖、分化及肿瘤细胞的多药耐药。GCS为神经酰胺糖基化的限速酶，具有底物特异性，对MDR的产生有重要作用。抑制GCS延缓神经酰胺糖基化，增加细胞内神经酰胺的含量已成为逆转MDR的有效策略。近期也发现了一些能抑制GCS的药物，但这些药物在临床应用中特异性不高，毒副

4、作用严重，难以达到逆转MDR的有效血浆浓度，并且肿瘤细胞也可以对这些药物郑州大学2007届博士学位论文葡萄糖神经酰胺合成酶小干扰RNA逆转胃癌多药耐药的研究产生耐药，其l艋床应用受到限制。虽然反义核酸技术也可逆转肿瘤MDR，但存在特异性不强、效率不高等缺点。因而迫切需要寻找有效的逆转肿瘤MDR的治疗策略。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一种由双链RNA介导的转录后基因沉默技术。由于RNAi抑制的高效性和特异性，被广泛应用于基因组功能和疾病治疗的研究中。在胃癌临床治疗中MDR是困扰化疗成功的一个主要因素，虽然众

5、多的研究者在逆转MDR方面作了大量工作，但迄今没有一种有效药物能很好的用于临床治疗。以往对胃癌MDR机理的研究多集中在多药耐药基因及P．即等方面，对于GCS与胃癌耐药关系的研究到目前为止国内外均未见报道。为探讨GCS在胃癌多药耐药中的作用以及靶向GCS小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)对胃癌耐药的影响，本课题首先采用RT．PCR、免疫组化和免疫印迹技术联合检测了几种胃癌细胞系中GCS基因的表达，揭示GCS与胃癌的发生发展与多药耐药的关系。在此基础上，以GCS基因为靶点，采用RNA干扰技术构建3个GCS

6、siRNA真核表达载体RI．pSUPEREGFP、R2-pSUPEREGFP、R3-pSUPEREGFP，并将其瞬时转染入人胃癌耐药细胞SGC7901／VCR，比较其对GCS的干扰效果，筛选出抑制作用强的重组质粒RI．pSUPEREGFP。进而用重组质粒R1-pSUPEREGFP稳定转染SGC7901NCR细胞，检测耐药相关基因GCS和mdrl的表达水平、凋亡相关因子bcl．2、bax、caspase-3表达的改变及细胞凋亡率，并观察转染细胞生长情况和对化疗药物的敏感性，最后将稳定转染的细胞导入裸鼠体内，观察GCSsiRNA对裸鼠移

7、植瘤生长的抑制作用及对移植瘤组织细胞凋亡和耐药相关基因GCS表达的影响。通过体外和体内试验，从基因、蛋白和肿瘤细胞生物学行为等多个方面研究GCS与胃癌多药耐药的关系及GCS引起MDR产生的分子机理，并深入探讨下调GCS的表达对逆转胃癌多药耐药的作用，为今后应用靶向GCSsiRNA载体作为临床增加胃癌患者化疗敏感性的手段和RNA干扰技术在胃癌临床基因治疗上的应用提供了可靠的理论依据。方法1．常规培养G鹳．1、BGC823、SGC790I和SC粉901／V'CR细胞。其中SGCV901／VCR细胞培养液中加入长春新碱(vincfisti

8、ne，VcR)0．5．-'1．0pg／ml，以维持其相应的n郑州大学2007届博士学位论文葡萄糖神经酰胺合威酶小干扰RNA逆转胃癌多药耐药的研究耐药表型。于检测前撤除VCR培养2周。2．应用RT-PCR、免疫组化和Westernblo