细胞实验rna的干扰

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1、细胞生物学实验动物细胞的转染与GFP的RNA干扰技术一、实验目的1、学习和掌握外源基因导入动物细胞的方法，观测外源基因的表达（绿色荧光蛋白），并了解细胞转染技术在细胞生物学相关领域的应用。2、学习和学握RNA干扰技术原理，学习观测利用化学合成的GFP-siRNA对GFP蛋口的抑制效果。二、实验原理（一）绿色荧光蛋白1、GFP荧光蛋白的发现1962年，下村修在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。它之所以能够发光，是因在其包含238个氨基酸的序列屮，第65至67个氨基酸（丝氨酸一酪氨酸一甘氨酸）残基,可自发地形成一

2、种荧光发色团。马丁•查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。1993年，他用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克隆到表达载体中，紫外光或者蓝光激发后，大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。1994年在美国《科学》杂志上发表《作为基因标识的绿色荧光蛋白》一文，尽管正文只有一页，却标志绿色荧光蛋口投入实验室应用。2、GFP荧光蛋口的应用GFP已被广泛应用于：细胞内分子标记、约物筛选、融合抗体基因表达检测、分子间相互作用等。GFP貝有如下特性：GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白能力比荧光素（fluo

3、rescein）强，特别在450〜490run蓝光波长下更稳定.GFP需要在氧化状态下产牛荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新眾露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱述原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定最测定与分析•但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放人效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋口.由于GFP荧光是牛:物细胞的口主功能，荧

4、光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.（二）转染1、转染（transfection）指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。2、真核细胞基因转染的方法（1）磷酸钙法：磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染，瞬时性转染不适用于原代细胞，操作简便但重复性差，有些细胞不适用。（2）DEAE-右旋糖营法：带正电的DEAE-右旋糖昔与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被

5、细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞冇一定的毒副作川，转染时需除血清。（3）阳离子性的脂质体法：带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染。3、影响转染的因素（1）转染试剂：最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。（2）细胞状态：一般低的细胞代数（＜50）能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经（3）过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。（4）细胞密度：细胞密度对转染效率有一泄的彩响。一般转染时贴壁细胞密度50%-90%,但这个需要参考所选转染试剂的说明书和后续

6、实验的要求。（5）血清：一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往耍求转染而后洗细胞或者在无血清培养基条件卜-转染,但有些对此験感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。不过转染产品配方几经革新后的今天，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，哄至还有助于提高转染效率，如阳离子聚合物等，血清的存在会影响DNA—转染复合物的形成，但只要在D：A-转染复合物形成吋用无血清培养基或PBS来稀释DNA和转染试剂就可以了，在转染过程中是可添加的。（6）抗生素：细胞培养过程中往往会添加抗生素

7、来防止污染，但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉索和链每索,就是影响转染的培养基添加物。这些抗牛索一般对于真核细胞无毒，但有-些转染试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。（7）氮磷（N/P）比：N/P比是转染效率的关键（为了换算方便，一般以DNA/转染试剂质量比表示），在一定比例范围内转染效率随N/P比成比例增高，之后达到平值，但毒性也随Z而增加，因此在实验Z前应根据推荐比例，确定本实验的最佳转染比例。（8）DNA质最：DNA质最对转染效率影响非常人。一般的转染技

8、术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋口，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。(三)RNAi(RNAinterference,RNA干扰)与靶基因同源的双链RNA诱导的特杲转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特弄的核酸酶降解,产生干扰小RNA(siRNA),这些siRNA与同源的靶RN