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1、RNA干扰基本实验路线RNAi是一种自然发生的基因沉默机制，应用于基因功能硏究和临床疾病治疗，就成为一种功能非常强大的工具。不过，开展RNAi实验并不难，不需要特殊的仪器,RNAi实验所需的4大要素一点不复杂：•对应目标基因的dsRNA⑸RNA,长dsRNA,shRNA载体，看实验需要)；•适合的转染或者其他将dsRNA递送进入细胞的方法•适当的对照；•检测目标基因表达情况的方法1.对应目标基因的dsRNA在非哺乳动物细胞中，直接向细胞导入长双链RNA(dsRNA),在细胞质核酸酶Dicer的作用下可将长双链RNA降解为21-23bp的小分子干扰RNA(smallinterferingR
2、NAs,siRNAs),这些小分子RNAs结合其他元件形成〃RNA诱导沉默复合物〃(RNA-inducedsilencingcomplexeszRISCs),并引导RISCs结合到与之互补的mRNA序列上，降解对应的mRNA,从而导致对应蛋白质水平下降,最终导致目标基因表达沉默,见下图(由权阳生物提供):UNWINDRNAcleavedmRNXNOPROTEINisMADEmismatchedRNAInducedSilencingComplexRISCsinglestrandsiRNAormicroRNAif2RNAstrandsarehighlycomplimentary・isclea
3、ved_if2RNAstarndsarepartlymismatched-RISCsticksto对匕匚mRNATTv•一图片由权阳生物提供对于哺乳动物细胞来说，导入30bp以上的长双链RNA(dsRNA)往往会诱发非预期的抗病毒应答反应，此路不通。所以常见的做法是直接制备19-23bp左右的siRNAs,将siRNAs转入哺乳动物细胞(线路2红色)或者是将短发夹结构RNA(shorthairpinRNAs,shRNAs)的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA,经过Dicer切割后得到siRNA(线路3,黄色)；最后siRNAs同样和其他元件组合成为RNA诱导的沉默复合物RISCs
4、,在siRNA指引下识别对应的mRNA序列并降解mRNA,从而使特定基因表达沉默。线路1和2均为诱发瞬时基因沉默，持续时间约3・7天，根据目标基因而异，shRNA表达载体则可以建立长效基因沉默的细胞株，进行功能缺失基因组筛选硏究，也可用于体内RNAi研究。市面上提供RNAi试剂的厂家越来越多，产品也格外丰富，如何选择呢？生物通参照这3条主要的RNAi实验线路的每个步骤，分别汇集介绍市售好用的相关产品，方便大家实验时作为选择的参考。2.适合的将dsRNA递送进入细胞的方法一旦拿到siRNAs或者dsRNA,还需要一种将双链RNA传递到细胞里的方法。传递的方法因细胞种类不同而异。对于线虫之类
5、的低等动物活体进行体内RNAi实验，多见以喂饲或者浸泡方法将dsRNA导入体内。体外培养细胞，多数的贴壁细胞可以用脂质体或者多胺类试剂来进行有效的转染；^于原代细胞或者悬浮细胞，如果常规转染方法不行可以用电转,甚至显微注I寸等，或者通过病毒载体感染等方法进行，病毒载体还可以作为哺乳动物体内RNAi实验的手段。3•设置适当的参照TransheepRNAi实验特别ebioTipsl:§设置好参照：适当的参照对于每个实验来说都是关键的,必须的，非常重要的。RNAi实验也不例外。缺少适当的参照，RNAi实验的结果就无从分析。§未转染细胞对照:不加转染试剂的空白对照,用于排除转染试剂对细胞活力的影
6、响（这个可以在摸转染条件时先做）§空白对照：只加转染试剂（如果实验用到载体则可做一组空载体对照），用于排除siRNA转染对细胞活力的影响§负对照：设置不针对目标细胞内源任I可基因的siRNA对照,用以排除转染siRNA对基因表达可能造成的任何非特异影响。§正对照:设置针对易于检测的参照基因的siRNAs,用于确证siRNAs的递送、转染以及反应条件环境是可行的。也有建议选择和目标基因同一信号通路的另一个基因作为参照，便于排除脱靶等副反应，以及进一步确认目标基因的功能。§好的实验设计应该选择至少2个以上针对同_目标基因的有效siRNAs同时平行做实验,以相互验证实验结果确实是由于目标基因沉
7、默而引起的,并非个别siRNA的特异现象。§可选：荧光标记的siRNAs对照便于检测siRNA递送效果
