RNA干扰09188

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1、RNA干扰吴xx指导：刘xxRNA干扰（RNAinterference，RNAi）RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。RNAi的发现简史90年代初，RichJorgensen设想，将更多的色素基因注入植物体，能使花朵的色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，当时称共抑制（cosuppression)。94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现

2、象，此称为基因压制(quelling)。95年Guo和kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA阻止一些基因的表达，给对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA同样的结果——特异性阻断该基因的表达，从而正式表明RNA干扰现象的存在。Fire等发现将dsRNA注入秀丽线虫可显著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后

3、的dsRNA注入线虫，却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反义RNA至少高几个数量，他们称此现象为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。图示Effectsofmex-3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA.NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridizationof4-cellstageembryos.(A)Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceo

4、fthehybridizationprobe.(B)Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex-3RNA(purplestaining).(C)Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex-3antisenseRNA.Theseembryos(andtheparentanimals)retainmex-3mRNA,althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype.(D)Late4-ce

5、llstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex-3;nomex-3RNAisdetected.(TemplatesusedforinterferingRNAandinsituprobeswerelargelynon-overlapping.)RNAi现象的普遍性随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。基因沉默转基因沉默分为转录水平的基因沉默(T

6、ranscriptionalGeneSilencing,TGS)和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)两种：TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默；PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。RNAi的作用机制目前普遍认为，共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制，都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA,抑制相应基因的表达。即RNAi、共抑制、quelling均属于PTGS！现已初步阐

7、明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步。第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端均有２~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。第二步（效应阶段）是siRNA在ATP参

8、与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。