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1、肿瘤治疗——RNA干扰093338刘忠柳outline什么是RNA干扰RNA干扰的机制RNA干扰和肿瘤治疗实例：乳腺癌什么是RNA干扰（RNAi）RNAi是指小分子双链RNA（dsRNA)抑制同源序列基因的表达目前，已知具有功能作用的小分子干扰RNA主要包括小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和PiwiinteractingRNA（piRNA）3类主要特征：1.特异性：RISC与目的基因mRNA地结合严格遵循碱基互补原则2.高效性RNAi过程中将以siRNA为引物，mRNA为模板不断地合成dsRNA，组装RISC,反应效果得以放大3.siRNA浓度依赖性
2、高浓度地siRNA不但增强反应效力，还能抵抗RNA依赖性腺苷酶对反应地抑制。4.dsRNA长度限制长度200-500bp地dsRNA能与Dicer酶较好的结合5.靶基因位点的选择作用的位点一般位于外显子内,对内含子和启动子无效RNAi机制siRNA引起的基因沉默细胞内的dsRNA被RNase!家族中双链特异的Dicer核糖核酸酶以ATP依赖的方式切割成siRNA。Dicer酶含有一个解螺旋酶结构域、一个PAZ结构域、一个dsRNA结合结构域和2个RNaseIU结构域。其中,PAZ结构域是Argonaute基因家族的保守结构域,与RNA结合有关。解螺旋酶结构域可能催化ds
3、RNA解螺旋,有利于Dicer酶切割。被Dicer酶切割成的siRNA具有相似的结构特征:长为21~23核苷酸(Nu?cleotide,nt)的双链RNA,5’单磷酸和3’羟基末端,互补双链的3’端均有2~3nt的单链突出。siRNA中的一条链与蛋白复合物结合后形成RISC,同时解链,正义链离开,然后反义链在ATP的作用下,通过碱基互补配对原则与同源的靶mRNA结合,在核酸内切酶的作用下,将靶mRNA切断,从而阻断其翻译成蛋白质RISC是一种核酸和蛋白质的复合物(包括蛋白质和siRNA),已经在果蝇和人类细胞中得到纯化,而且都含有Argonaute蛋白家族的成员[8],
4、这种蛋白被认为是RISC复合物的核心成分。另一种情况是,与mRNA结合后,在依赖于RNA的聚合酶作用下以mRNA为模板、siRNA为引物指导合成dsRNA,然后Dicer酶再切割,导致mRNA的降解miRNA诱导的基因沉默?miRNA主要是通过抑制翻译过程来实现基因的沉默。大多数miRNA与底物mRNA不完全配对结合,成熟的双链miRNA会很快被整合miRISC中。成熟miRNA结合到与其序列互补的mRNA位点,通过2种依赖于序列互补机制负性调控靶基因的表达。通过抑制翻译还是降解而发挥作用是由miRNA和它的目的mRNA之间的错配程度决定的,由于miRNA可以对不完全互
5、补的mRNA配对来抑制蛋白质的翻译过程,因而每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNA可以调节同一个基因。RNA干扰和肿瘤治疗最初RNAi在肿瘤学的应用主要是针对突变的肿瘤基因、增生、转位和病毒基因，阐明其功能以及和其它基因之间的相互联系。应用RNAi技术探索各种基因的功能及相互作用为筛选新的药物靶基因提供了便利。RNAi已用来加强现存药物如伊马替尼（imatinib）和雷帕霉素的作用。现在RNAi还主要运用于研究方面。未来的方向主要是把RNAi从研究中广泛地运用到临床的恶性肿瘤治疗上。RNAi所面临的问题RNAi用于临床肿瘤治疗要解决两个问题，首先如何把有效的干
6、扰RNA带到肿瘤细胞内，对特异性靶基因产生特异性的抑制作用；其次，如何避免RNAi带来的副作用。载体问题血流中的siRNA或DNA很难通过细胞膜屏障和逃避内体溶酶体的降解作用。为了提高siRNA的运载效率，学者们发展了很多病毒和非病毒运载体系，大大提高了运载siRNA的效率。如基于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒的运载系统在体内外均实现了RNAi介导的基因沉默；阳离子脂质体或聚乙醇胺均用作siRNA运载体。壳聚糖是一种阳离子多糖，已广泛用于药物的运载，特别是DNA介导的基因治疗药物的运载。脱靶效应如果考虑将siRNA作为治疗药物，须考虑它的序列特异性和评估它的脱靶效应的危
7、险性。siRNA产生脱靶效应主要基于以下3个方面：（1）由于siRNA均含有dsRNA序列，因此它可能会诱发机体的天然免疫应答，如干扰素应答。（2）转染或表达的siRNA可能会产生一些非特异性效应。（3）尽管设计的siRNA与目的基因互补，但也可能和非靶基因mRNA互补。RNAi的致命缺陷美国研究人员发现,接受特定RNA(核糖核酸)干扰技术治疗的实验鼠,可能会死于肝功能衰竭或并发症。RNA干扰是近几年发展起来的一项医学技术,它能够定向关闭生物体内的某一基因,使其不发挥作用。研究人员们由此认为,采用RNA干扰技术直接从源头上让致病基因“沉默
