rna干扰技术基本原理与应用20031

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1、RNA干扰技术基本原理与应用什么是RNA干扰RNA干扰(RNAinterference，RNAi),又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降.2001、2002年连续被Science评为年度十大成就!目前应用的基因干扰技术DNA水平的基因干扰技术基因敲除技术寡核苷酸与双链DNA杂交采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子目前应用的基因干扰技术mRNA水平的基因干扰技术用

2、反义RNA技术阻遏翻译过程,破坏内源性mRNA设计寡核苷酸来破坏与mRNA结合的蛋白质,使mRNA不稳定双链RNA干扰技术（RNAi）RNAi的发现和发展历程1984年,Jonathan研究小鼠L细胞时发现反义mRNA会干扰同源基因的表达，机制不清1990年Jorgensen等矮牵牛颜色加深实验“共抑制(co-suppresion)”RNAi的发现和发展历程1995年SuGuo和KenEmphues反义RNA阻断秀丽小杆线虫par-1基因的表达实验首次发现RNA干扰现象1998年AndrewFire和Craig

3、Mello发现单链RNA抑制作用较弱，而纯化的dsRNA可高效、特异地抑制基因的表达Nature1998；391:806-11正式提出RNA干扰的概念RNAi的发现和发展历程1999年Tuschl等报道在哺乳动物中也存在RNAi2001年Berstein等提出只有22核苷酸dsRNA才有特异性的阻断效应，并发现体内分解dsRNA为siRNAs(short/smallinterferingRNA)的DICER酶RNAi的发现和发展历程2002年Novina等用RNAi技术实现了对HIV-1病毒的阻抑2004年Mo

4、rris等用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制Science2004(August27)；305：1289-1292RNAi的主要特点和优势诱导转录后水平的基因沉默具有高度的特异性抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去“基因沉默系统化”siRNA与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶共同点特异性靶向性siRNA与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶不同点独特的双链结构需要Dicer、RdRp、解旋酶、激酶等协同因子siRNA本身无催化活性在细胞内可能具有相对的稳定性具有一定的可遗传性RNAi的主要过程启动阶

5、段dsRNA(500nt左右最佳)被Dicer酶特异性识别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成siRNA长度：21-25nt结构：3ˊ端悬垂两个未配对的碱基UU细胞中内源性dsRNA的形成基因组中DNA反向重复序列的转录产物同时转录反义和正义RNA病毒RNA复制中间体以单链RNA为模板由细胞或病毒的RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)催化合成dsRNADicer酶RNAaseIII超家族成员。结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点对单链RNA没有活性对200~500nt的dsRNA

6、作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA广泛存在RdRp（RNAdependentRNApolymerase）使异常的RNA转变为dsRNA参与细胞内dsRNA和siRNA的扩增siRNA与靶mRNA的结合可激活RdRp，形成大量的dsRNARNAi的主要过程效应阶段RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的形成RISC的激活：ATP依赖的解双链过程在siRNA反义链的指导下(靶序列的识别），RISC特异性切割、降解靶mRNA，导致基因表达失活RNAi技术的

7、实验方法siRNA的设计原则序列大小19-21nt，最好以A或G开始从mRNA的AUG开始，寻找AA二连序列，作为潜在的RNAi靶位点不要针对5‘和3’端非编码区（untranslatedregions，UTRs)RNAi技术的实验方法siRNA的设计原则设计2~4个序列,BLAST比对基因序列以确保序列设计的特异性优先选择GC含量30-50%的序列设计适当的阴性对照序列阴性对照序列的设计特异性siRNA中的碱基进行随机排列，且行BLAST基因比对AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGATTCGTGCTCAA

8、TGCAATCG在特异性siRNA引入1~2个错配碱基AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAGTTTAAATCCTAG目标序列筛选的相关网站http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp://sfold.wadsworth.org/sirna.plhttp://biotools.idtdna.com/rnai/http